Д.С. Иванов

В 1998 году группа Джеймса Томсона впервые в мире сообщила об успешном получении линий эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека [1]. C тех пор этот тип клеток рассматривается учеными и клиницистами, как один из наиболее перспективных клеточных ресурсов для использования в регенеративной медицине. Прежде всего, это связано с уникальными свойствами ЭСК – неограниченным самообновлением в специальных условиях in vitro и плюрипотентностью. Эти две основные особенности являются ключевыми предпосылками для массового промышленного производства клеточных продуктов на их основе. С другой стороны, разработка клеточных продуктов на основе ЭСК и их производных представляет собой достаточно сложную в техническом плане задачу, так как является многоступенчатым процессом, требующим соблюдения стандартов GMP и GTP, отказа от использования расходных материалов животного происхождения, наличия квалифицированного персонала и т.д. Кроме того, полученные экспериментальные данные позволяют считать, что введение человеку аллогенных ЭСК или их производных может приводить к возникновению таких побочных эффектов, как формирование тератом и даже тератокарцином, а также иммунному отторжению трансплантата. В связи с этим, вплоть до недавнего времени, клинические испытания с введением ЭСК или их производных не проводились.

В январе 2009 года американская компания Geron, приложив поистине титанические усилия, получила разрешение FDA на начало первого в мире клинического исследования с использованием производных ЭСК. Несмотря на то, что по финансовым причинам триал был закрыт, это событие стало прецедентом, после которого возможность инициировать клинические испытания с производными ЭСК получили и другие компании. В частности, компания Advanced Cell Technology в ноябре 2010 года получила разрешение FDA на начало двух клинических исследований I/II фазы по лечению возрастной макулярной дегенерации и дистрофии Штаргардта путем трансплантации аллогенных клеток пигментного эпителия сетчатки, полученных путем направленной дифференцировки ЭСК in vitro. Предварительные результаты этих испытаний для первых двух пациенток были недавно опубликованы в The Lancet.   

Для получения клеток ПЭС авторы использовали линию ЭСК MA09, которая была выведена с помощью запатентованной Advanced Cell Technology технологии «одного бластомера» [2]. MA09-ПЭС выделялись согласно ранее разработанным протоколам с соблюдением стандартов GMP [3]. В результате контролируемой дифференцировки ЭСК достигалась высокая чистота культуры MA09-ПЭС – более 99% клеток. Они имели типичную для ПЭС морфологию, экспрессировали транзиторный маркер нейроэктодермальной дифференцировки PAX6 и маркеры ПЭС RPE65, бестрофин-1 и MITF, тогда как экспрессия маркеров плюрипотентности Oct4, Nanog и Sox2 была подавлена. Более 85% клеток были способны фагоцитировать окружающие микрочастицы. В окончательном продукте клетки имели нормальный женский кариотип (46  XX), а недифференцированные ЭСК не выявлялись даже при использовании высокочувствительных методов обнаружения. Исследования на иммунодефицитных животных показали, что субретинальное введение MA09-ПЭС не приводит к каким-либо побочным эффектам. Тератомы не формировались, даже если MA09-ПЭС смешивались с небольшим количеством недифференцированных ЭСК (0,01%, 0,1% или 1% от общего количества вводимых клеток). В тоже время введение чистой фракции ЭСК приводило к формированию тератом в течение 2 мес. у всех животных. MA09-ПЭС клетки благополучно интегрировались в слой пигментного эпителия сетчатки мыши. 

В клиническом исследовании двум пациенткам с продвинутыми стадиями заболевания (возрастная макулярная дегенерация и дистрофия Штаргардта) проводилась субмакулярная инъекция 150 мкл суспензии, содержащей около 50000 клеток MA09-ПЭС. Трансплантация проводилась в один глаз каждой из испытуемых в места, в которых по данным оптической когерентной томографии присутствовал слой ПЭС, хоть и затронутый патологическим процессом. По мнению авторов это увеличивало вероятность интеграции вводимых клеток, так как в местах, в которых ПЭС подвергается полной дегенерации, обычно также наблюдается дегенерация оболочки Бруха, в состав которого входит базальная мембрана ПЭС. Кроме того, авторы полагают, что основными показанием для трансплантации полученных из ЭСК клеток ПЭС будут ранние стадии перечисленных выше заболеваний, когда еще не наблюдается участков полной атрофии сетчатки.

За неделю до трансплантации и 12 недель после пациенткам проводилась иммуносупрессивная терапия низкими дозами такролимуса и микофенолата мофетила.

Обе испытуемых хорошо перенесли процедуру трансплантации, ни одной из них не понадобилось постоперативное обезболивание. Кровоизлияния в конъюнктиву и гиперемия разрешились в течение первой недели после трансплантации. Инъекция 150 мкл суспензии клеток приводило к формированию субретинальных пузырьков, что, теоритически, может приводить к отслойке сетчатки. Однако наблюдение в раннем посттрансплантационном периоде показало, что в течение 4 часов поверхность сетчатки полностью выравнивалась и, таким образом, каких-либо признаков отслоения сетчатки не выявлялось.

Ни у одной из пациенток в течение 4 месяцев после трансплантации не наблюдалось каких-либо признаков гиперпролиферации и аномального роста. Отсутствие тератом подтверждалась по данным серийных исследований, включая спектральную оптическую когерентную томографию, высокоразрешающую фотографию глазного дна, визуализацию автофлюоресценции глазного дна и флуоресцентную ангиографию. Также не наблюдалось роста/миграции клеток за пределы субретинального пространства. При сканировании преретинального пространства с помощью спектральной оптической когерентной томографии были обнаружены единичные пигментированные клетки на поверхности сетчатки у пациентки с дистрофией Штаргардта, которые  располагались возле места прокола. Пролиферация и миграция этих клеток не выявлялась. На протяжении всего периода наблюдения у пациенток не возникало каких-либо признаков внутриглазных воспалительных процессов. 

Авторы не смогли подтвердить приживление трансплантата у пациентки с возрастной макулярной дегенерацией, что сложно сделать без проведения иммуногистохимических исследований. С другой стороны, у пациентки с дистрофией Штаргардта наблюдалось постепенное увеличение пигментации на уровне ПЭС в области введения клеток с 1 недели до 3 месяцев. MA09-ПЭС заселяли области, в которых ранее наблюдалась полная атрофия ПЭС, так же как и области, в которых ПЭС был затронут патологическим процессом, но все еще выявлялся. Данные спектральной оптической когерентной томографии, выполненной через 3 месяца после трансплантации, свидетельствовали о благополучном приживлении трансплантата.

Цветные фотографии глазного дня выского разрешения и изображения, полученные с помощью оптической когерентной томографии (ОКТ), у пациентки с болезнью Штадгардта до (сверху) и 3 недели после (снизу) трансплантации. На снимках ОКТ внизу выявляются увеличение пигментации на уровне ПЭС и формирование нормального монослоя клеток.    

Несмотря на что авторы не смогли обнаружить признаки приживления трансплантата у одной из пациенток, у обеих испытуемых в течение периода наблюдения отмечалось увеличение остроты зрения. У пациентки с возрастной макулярной дегенерацией в течение 2 недель после введения клеток острота зрения возросла с базовых 20/500 до 20/200. На 6 неделе она составляла 20/320 и оставалась на таком уровне на протяжении всего периода наблюдения. Не было отмечено уменьшение полей зрения. Интересно, что умеренно выраженные положительные изменения зрительных функций в посттрансплантационном периоде наблюдались и во втором глазе.  

У пациентки с дистрофией Штаргардта отмечалось четкое функционалиьное улучшение зрения. До начала лечения она могла различать с помощью центрального зрения лишь движение руки. Уже через 2 недели после трансплантации испытуемая различала движение пальцев. Наилучшая острота зрения в период наблюдения достигала 20/800. Пациентка отмечала улучшение качества цветного зрения и темновой адаптации. В то же время во втором глазе каких-либо положительных изменений не наблюдалось.

Таким образом, данная работа является первым в мировой практике детальным клиническим сообщением о введении производных ЭСК человеку. Авторы не выявили каких-либо серьезных побочных эффектов трансплантации на протяжении 3-4 месяцев наблюдения, включая аномальную пролиферацию клеток, формирование тератом и отторжение трансплантата. Более того, даже без иммуногистохимических методов исследования удалось подтвердить приживление вводимых клеток у одной из пациенток.

По материалам:

Schwartz S.D., Hubschman J.-P., Heilwell G. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. The Lancet, Early Online Publication, 24 January 2012.

Литература:

1. Thomson J.A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S.S.et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 1998;282(5391):1145-7.

2. Klimanskaya I., Chung Y., Becker S., Lu S.J., Lanza R. Human embryonic stem cell lines derived from single blastomeres. Nature 2006;444(7118):481-5.

3. Lu B., Malcuit C., Wang S. et al. Long-term safety and function of RPE from human embryonic stem cells in preclinical models of macular degeneration. Stem Cells 2009;27(9):2126-35.