Одной из наиболее эффективных технологий предназначенных для разработки новых лекарственных средств, в настоящее время является высокопроизводительный скрининг, представляющий собой автоматизированную процедуру, при которой большое количество химический соединений (тысячи или миллионы образцов) проверяются на активность по отношению к какой-либо тестовой системе, имитирующей тот или иной биологический процесс. В качестве стартового набора химических веществ, как правило, используются собственные или коммерчески доступные «библиотеки соединений». Основной задачей высокопроизводительного скрининга является выявление химических веществ, способных после дальнейшей оптимизации стать прототипами лекарственных препаратов для проведения доклинических и клинических исследований. Высокопроизводительный скрининг используется и для поиска новых препаратов, предназначенных для лечения онкогематологических заболеваний. В качестве тестовой системы в данном случае обычно используются широко известные линии лейкозных клеток, например HL-60 и THP1. В ходе процесса изучается влияние химических веществ из библиотеки соединений на пролиферацию клеток этих линий. С помощью этого подхода были идентифицированы такие противоопухолевые препараты как цитарабин и митоксантрон.

В 90 годах XX века исследовательская группа из Канады, возглавляемая профессором John E. Dick, опубликовала ряд работ, в которых в опытах с ксенотрансплантацией лейкозных клеток иммунодефицитным мышам было показано, что в патогенезе острого миелобластного лейкоза (ОМЛ) ключевую роль играет малочисленная популяция клеток [1, 2]. Эти клетки получили название лейкоз-инициирующие клетки или лейкозные стволовые клетки (ЛСК). В дальнейших исследованиях было выявлено, что ЛСК обладают уникальными характеристиками, которые обуславливают их высокую резистентность к практически всему спектру терапевтических воздействий, применяемых при лечении ОМЛ [3].

Учитывая ключевую роль ЛСК в патогенезе ОМЛ, становится очевидной острая необходимость разработки пригодных для высокопроизводительного скрининга тестовых систем, с помощью которых было бы возможно оценивать влияние химических веществ на жизнедеятельность ЛСК. Однако создание таких тестовых систем представляется сложной задачей. Это обусловлено, во-первых, малым количеством ЛСК в первичных образцах крови или костного мозга от пациентов с ОМЛ, во-вторых, невозможностью выделения чистой фракции ЛСК с помощью магнитной сепарации и FACS из-за отсутствия надежных позитивных маркеров, в-третьих, отсутствием протоколов культивирования, обеспечивающих длительное поддержание и экспансию ЛСК in vitro.

В новом исследовании группы John E. Dick, опубликованном в Blood, сообщается о разработке многошагового подхода, позволяющего идентифицировать химические вещества, воздействующие на ЛСК, с помощью высокопроизводительного скрининга.

Авторы использовали две новые линии лейкозных клеток, TEX и M9-ENL1, полученных при трансдукции онкогенами негативных по линейным маркерам гемопоэтических стволовых/прогениторных клеток пуповинной крови (ГСПК Lin- ПК) [4, 5]. Линия TEX была получена при трансдукции ГСПК Lin- ПК онкогеном TLS-ERG. При последующем культивировании клетки были иммортализованы и окончательно трансформированы путем отбора колоний с дополнительными генетическими изменениями, приводивших к экспрессии hTERT и ассоциированного со «стволовостью» гена BMI1, а также маркеров CD34, CD44 и CD123. Сравнительный анализ паттернов экспрессии генов показал, что в отличие от HL-60 и THP1 паттерн экспрессии клеток линии TEX в значительной степени перекрывается с паттерном экспрессии ЛСК ОМЛ. Лимитирующие разведения и последующие ксенотрансплантации показали, что клетки линии TEX являются гетерогенными, и небольшая субпопуляция обладает активностью ЛСК (1 на 3,5×105 клеток). Стабильное состояние культуры клеток линии TEX поддерживается в присутствии SCF, IL-3 и сыворотки крови, в то время как удаление одного из цитокинов приводит к индукции терминальной дифференцировки клеток.

Линия M9-ENL1 была получена при трансдукции ГСПК Lin- ПК онкогеном MLL-ENL. Практически все клетки этой линии обладают активностью ЛСК. В то же время, при стимуляции некоторыми цитокинами M9-ENL1-клетки приобретают некоторые черты дифференцированных гемопоэтических клеток. Паттерн экспрессии генов клеток этой линии в значительной степени перекрывается с паттернами экспрессии ЭСК и предшественниц B-клеток. Введение M9-ENL1-клеток иммунодефицитным мышам приводит к быстрому развитию фатального В-клеточного ОМЛ.

Таким образом, полученные линии предоставляют возможность для скрининга потенциальных агентов, мишенью которых являются ЛСК, так как их рост можно поддерживать в культуре и, в отличие от большинства известных линий лейкозных клеток, они в определенной мере сохраняют характерную для лейкозных клеток структуру иерархической организации.

Для оценки перспективы использования полученных линий в качестве тестовой системы, позволяющей выявить активные в отношении ЛСК химические соединения, авторы провели скрининг около 4000 химических веществ из 3 библиотек на предмет ингибирования роста TEX и M9-ENL1 клеток. 80 химических соединений снижали интенсивность пролиферации клеток обеих линий более чем на 75 процентов. Некоторые из них, такие как цитарабин и митоксантрон, являлись уже известными в настоящее время противоопухолевыми препаратами. Половина из 80 идентифицированных веществ соответствовала правилам пяти Липинского [6], что говорит об их потенциальной пероральной биодоступности.

Для исключения соединений, которые проявляют высокую степень цитотоксичности по отношению к нормальным гемопоэтическим клеткам, исследовалось влияние идентифицированных веществ на ГСПК Lin- ПК. Было выявлено 10 химических веществ, которые проявляли высокую степень токсичности в отношении клеток линий TEX и M9-ENL1 и значительно меньшую в отношении ГСПК Lin- ПК. Одно из них, кинетин рибозид (КР), было в три раза менее токсично в отношении ГСПК Lin- ПК в сравнении с клетками линии TEX.

Пациенты с ОМЛ характеризуются очень высокой вариабельностью по степени чувствительности к применяемым схемам лечения, и как следствие, высокой вариабельностью в выживаемости. Также как и все другие доклинические модели, используемые в данном исследовании клеточные линии не способны отражать подобную гетерогенность. Поэтому в дальнейших экспериментах авторы изучали влияние КР на пролиферацию лейкозных клеток из 63 первичных образцов, полученных от пациентов с ОМЛ и ХМЛ, в коротком 4-дневном эксперименте in vitro. КР продемонстрировал высокую степень токсичности, сравнимую с препаратами, используемыми для индукционной терапии ОМЛ (цитарабин, митоксантрон). КР был одинаково эффективен в отношении всех субтипов ОМЛ согласно FAB-классификации, за исключением M3-варианта, клетки которого не растут в используемых условиях культивирования.

Для оценки токсичности препарата в отношении к ЛСК, исследовалась способность КР к индукции апоптоза в обогащённых ЛСК фракциях лейкозных клеток из 11 первичных образцов. КР в низких микромолярных концентрациях эффективно индуцировал апоптоз во всех фракциях лейкозных клеток, включая обогащенные по ЛСК CD34+CD38- и CD34+CD38+ субпопуляции. В то же время, КР проявлял низкую активность в отношении нормальных гемопоэтических клеток (ГСПК Lin- ПК). Таким образом, в опытах in vitro было показано, что КР можно использовать для селективного уничтожения ЛСК.

Для подтверждения эффективности КР в отношении ЛСК invivo клетки из 4 первичных образов от пациентов с ОМЛ культивировались с препаратом invitro в течение 16 часов, а затем вводились внтурикостно сублетально облученным NOD/SCID мышам. Приживление оценивалось с помощью специфичных для CD45 человека антител и антител к линейным маркерам. Кратковременная обработка КР привела практически к полному подавлению активности ЛСК в 2 из 4 образцов, что, по-видимому, говорит о существенной межиндивидуальной вариабельности в чувствительности ЛСК к исследуемому препарату. В то же время, несмотря на низкую степень токсичности КР в отношении нормальных гемопоэтических клеток in vitro, в опытах in vivo предварительная инкубация с КР приводила к заметному ингибированию приживления ГСПК Lin- ПК у иммунодефицитных мышей.

Для выявления механизмов цитотоксического эффекта препарата, авторы провели серию исследований, направленных на изучение эффектов КР на ряд ключевых сигнальных каскадов. Было выявлено, что обработка лейкозных клеток КР в использованных в исследованиях режимах приводит к расщеплению каспазы 3, снижению мембранного потенциала митохондрий и, как следствие, активации апоптоза. Тем не менее, в этот процесс не были вовлечены повреждения ДНК, генерация активных форм кислорода и p53. Эффективность KР, представляющего собой модифицированный аденозин, зависела от активности аденозинкиназы, которая в норме переносит фосфатную группу к аденозину с формированием аденозинмонофосфата (АМФ). С другой стороны ингибирование аденилатциклазы и аденилаткиназы, участвующие в дальнейшем метаболизме АМФ, не оказывало какого-либо влияния на эффекты КР, также как и ингибирование АМФ-киназного сигнального пути, играющего ключевую роль в поддержании постоянства энергетического обмена клеток. В настоящем исследовании так и не удалось идентифицировать точные механизмы токсического эффекта КР, а также, что особенно интересно, причины его селективной избирательности в отношении лейкозных клеток.

Таким образом, в данном исследовании авторы впервые разработали подход, позволяющий осуществлять высокопроизводительный скрининг химических веществ по отношению к ЛСК. В работе была продемонстрирована эффективность такой стратегии – в результате скрининга 4000 химических веществ было идентифицировано специфически воздействующее на ЛСК соединение, кинетинрибозид, которое имеет относительно низкую токсичность по отношению к нормальным гемопоэтическим клеткам. В предложенном протоколе можно выделить следующие этапы: 1) скрининг больших количеств химических веществ на предмет подавления роста клеток линий TEX и M9-ENL1, являющихся invitroмоделью ЛСК; 2) селекция идентифицированных соединений на предмет низкой токсичности к нормальным гемопоэтическим клеткам и, в перспективе, к клеткам других тканей и органов; 3) подтверждение анти-ЛСК активности на лейкозных клетках из первичных образцов in vitro и на модели ксенотрансплантации иммунодефицитным мышам in vivo; 4) сравнение цитотоксических эффектов исследуемых соединений и препаратов, уже использующихся для лечения гемобластозов; 5) определение конкретных молекулярных механизмов цитотоксического действия идентифицированных химических веществ. Не исключено, что разработанная авторами стратегия станет отправной точкой для идентификации и разработки новой группы высокоэффективных препаратов, использование которых в клинике приведет к революции в лечении, как лейкозов, так и других групп новообразований.

По материалам:

McDermott S.P., Eppert K., Notta F.et al. A small molecule screening strategy with validation on human leukemia stem cells uncovers the therapeutic efficacy of kinetin riboside.Blood.2011 Dec 9.[Epub ahead of print].

Литература:

1. Lapidot T., Sirard C., Vormoor J. et al. A cell-initiating human acute myeloid leukemia after transplantation into SCID mice. Nature 1994;367:645-8.

2. Bonnet D., Dick J.E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat. Med. 1997;3:730-37.

3. Thomas X., Cannas G. Leukemia stem cells and new strategies to overcome resistance to therapy. Curr Stem Cell Res Ther. 2010;5(3):277-86.

4. Warner J.K., Wang J.C., Takenaka K. et al. Direct evidence for cooperating genetic events in the leukemic transformation of normal human hematopoietic cells. Leukemia 2005;19(10):1794-805.

5. Barabe F., Kennedy J.A., Hope K.J., Dick J.E. Modeling the initiation and progression of human acute leukemia in mice. Science 2007;316(5824):600-4.

6. Lipinski C.A., Lombardo F., Dominy B.W., Feeney P.J. Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings. Adv Drug Deliv Rev. 2001;46(1-3):3-26.