Д.С. Иванов

Самообновление и дифференцировка гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) регулируются сигналами специфического микроокружения, так называемых костномозговых ниш. В формировании ниш принимают участие многие типы клеток, включая остеобласты, клетки эндотелия, обильно экспрессирующие CXCL12 ретикулярные клетки (CXCL12-abundant reticular (CAR) cells), мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) и даже симпатические нервные волокна [1]. В нишах ГСК могут находиться в состоянии покоя, а могут активно пролиферировать, в связи с чем, в настоящее время выдвинута концепция о существовании двух основных типов костномозговых ниш: эндостальной и периваскулярной [2]. Периваскулярная ниша образована, главным образом, CAR-клетками, ММСК и эндотелиоцитами синусойдных капилляров. ГСК в составе периваскулярных ниш, как правило, активно пролиферируют. Компонентами эндостальных ниш являются выстилающие кость клетки (остеобласты) и ММСК. ГСК в эндостальных нишах, как правило, находятся в состоянии покоя (гибернации). Конкретные межклеточные взаимодействия и молекулярные механизмы, которые обуславливают статус клеточного цикла ГСК, покой или пролиферация, в разных типах костномозговых ниш до сих пор остаются неясными.

Группа H. Nakauchi недавно опубликовала в Cell результаты своего исследования, в котором они идентифицировали новый компонент костномозговых ниш, Шванновские клетки, которые играют ключевую роль в поддержании ГСК в состоянии гибернации.

В предыдущих исследованиях H. Nakauchi et al. показали, что активируемый TGF-b сигнальный каскад поддерживает ГСК в состоянии покоя путем ингибирования кластеризации липидных рафтов, что приводит к подавлению тирозин-киназ Src и сигнальных путей, опосредующих пролиферацию ГСК [3]. TGF-b секретируется многими типами клеток костного мозга в неактивной форме в виде комплекса с белками, который получил название «большой латентный комплекс» (Large Latent Complex (LLC)). Однако механизмы, благодаря которым происходит высвобождение активной формы TGF-b, до сих пор оставались малоизученными.   

В текущем исследовании авторы пытались выяснить – какие типы клеток костномозговых ниш принимают активное участие в активации TGF-b. Для этого они использовали флуоресцентные антитела к LAPи TGF-b. LAP входит в состав LLC (см. рис) и, таким образом, с помощью анти-LAP антител можно идентифицировать неактивную форму TGF-b. В свою очередь выбранные анти-TGF-b антитела связываются только с активной формой TGF-b. Иммуногистохимическое окрашивание показало, что анти-LAP антитела связывались со многими типами клеток, включая даже мегакариоциты. В тоже время анти-TGF-b антитела связывались только с дискретной небольшой популяцией LAP-позитивных клеток костного мозга, скопление которых имело вид длинных веретенообразных структур.

Высвобождение активной формы TGF-b из LLC происходит при протеолитической деградации LAP матриксными металлопротеиназами (см. рис). Этому процессу предшествует связывание LLC с интегринами ανβ6 и ανβ8 [4,5]. Иммуногистохимическое исследование показало, что интегрин ανβ6 клетками костного мозга не экспрессируется, тогда как интегрин ανβ8 выявлялся только на тех клетках, которые окрашивались анти-TGF-b антителами.  

Ранее было описано, что интегрин ανβ8 может экспрессироваться на Шванновских клетках [6]. Детальные иммуногистохимические исследования с использованием меченных антител к GFAP (глиальный фибриллярный кислый белок), MPB (основной белок миелина), S100B (использовался как маркер клеток глии) и белкам нейрофиламентов показали, что экспрессирующие интегрин ανβ8 клетки костного мозга являются не экспрессирующими миелин Шванновскими клетками, которые располагаются вдоль мелких постганглионарных аксонов вегетативной нервной системы. В свою очередь, окрашивание меченными антителами к PDGFRa (маркер ММСК) и VE-кадгерину (маркер клеток эндотелия) и гладкомышечному актину (использовался как маркер перицитов) позволило исключить участие этих клеток в процессах высвобождения активной формы TGF-b. Кроме того, отсутствие экспрессии интегрина ανβ8 гемопоэтическими и стромальными клетками костного мозга было показано с помощью ОТ-ПЦР.

Рис.: Предполагаемая модель, описывающая процесс высвобождения активной формы TGF-b в нишах ГСК костного мозга. ВКМ - внеклеточный матрикс. По K. Bruckner c изм. (2011). 

Находятся ли Шванновские клетки в контакте с ГСК? Для ответа на этот вопрос срезы костного мозга окрашивались антителами к маркерам ГСК (CD150, CD48, CD41 и линейные маркеры), Шванновских клеток (GFAP), остеобластов (остеокальцин) и VE-кадгерину (маркер клеток эндотелия). Позиционные взаимоотношения между клетками и  количественная оценка производилась с помощью имаджинг-системы ArrayScan. Экспрессирующие GFAP клетки глии находились в прямом контакте в среднем с 23% CD150+CD48-CD41-Lin- ГСК, тогда как в среднем 13% и 30% ГСК находились в прямом контакте с, соответственно, остеобластами и эндотелиоцитами. Приблизительно 30% ГСК не контактировали ни с одним из перечисленных типов клеток, что может быть обусловлено артефактом, связанным с недостатками сканирования в двух измерениях (2D), или же тем, что эта часть ГСК контактировала с каким-либо другим типом клеток. 

Клетки глии зависят от трофической поддержки от ассоциированных с ними нейронов. Авторы воспользовались этим фактом для удаления Шванновских клеток из костного мозга бедренных костей мышей путем одностороннего пересечения симпатического ствола на уровне L2-L4, что привело к практически полному исчезновениюGFAP-положительных, так же как и позитивных по активному TGF-b, клеток в костном мозге. Несмотря на то, что концентрация ядросодержащих клеток костного мозга, полученных с обеих бедренных костей, не различалась на всем периоде наблюдения, уже с третьего дня после операции наблюдалось снижение количества ГСК в образцах, полученных с прооперированной стороны. Максимальная разница (20%) в количестве ГСК достигала к 7 дню. При этом остеобласты, клетки эндотелия и ММСК оставались сохранными.

Обеднение ГСК в костном мозге было показано в экспериментах с трансплантацией. Введение клеток костного мозга бедренной кости с денервированной стороны сублетально облученным мышам приводило к возникновению донорского химеризма в гораздо меньшей степени в сравнении с введением аналогичных клеток с противоположной стороны (в среднем 12,4% против 53,5%).

Анализ клеточного цикла ГСК с обеих сторон показал, что ГСК с денервированной стороны в значительно большей степени находились в состоянии пролиферации. Эти данные говорят о том, что Шванновские клетки, являющиеся компонентами костномозговых ниш, поддерживают ГСК в состоянии гибернации путем высвобождения активной формы TGF-b. В пользу этой концепции свидетельствуют эффекты, которые опосредуют на ГСК вводимые экзогенно активные и латентные формы TGF-b. Только введение активной формы приводило к ингибированию пролиферации ГСК в костном мозге денервированного бедра.

Таким образом, в данном исследовании авторы показали, что одним из компонентов гемопоэтических ниш костного мозга является дискретная популяция клеток, которые по ряду признаков соответствует не экспрессирующим миелин Шванновским клеткам. Этому виду глиальных клеток костного мозга, по-видимому, принадлежит исключительная роль в продукции активной формы TGF-b, одной из функций которого является поддержание ГСК в состоянии покоя.     

По материалам:

Yamazaki S., Ema H., Karlsson G. et al. Nonmyelinating Schwann cells maintain hematopoietic stem cell hibernation in the bone marrow niche. Cell 2011;147(5):1146-58.

Литература:

1. Nagasawa T., Omatsu Y., Sugiyama T. Control of hematopoietic stem cells by the bone marrow stromal niche: the role of reticular cells. Trends Immunol. 2011;32(7):315-20.

2. Ehninger A., Trumpp A. The bone marrow stem cell niche grows up: mesenchymal stem cells and macrophages move in. J Exp Med. 2011;208(3):421-8.

3. Yamazaki S., Iwama A., Takayanagi S. et al. TGF-beta as a candidate bone marrow niche signal to induce hematopoietic stem cell hibernation. Blood 2009;113:1250–6.

4. Munger J.S., Huang X., Kawakatsu H. et al. The integrin alpha v beta 6 binds and activates latent TGF beta 1: a mechanism for regulating pulmonary inflammation and fibrosis. Cell 1999;96:319–328.

5. Mu D., Cambier S., Fjellbirkeland L. et al. The integrin alpha(v)beta8 mediates epithelial homeostasis through MT1-MMP-dependent activation of TGF-beta 1. J Cell Biol. 2002;157:493–507.

6. Chernousov M.A., Carey D.J. alphaVbeta8 integrin is a Schwann cell receptor for fibrin. Exp. Cell Res. 2003;291:514–24.