А.Г. Малюта

Пигментный эпителий сетчатки (ПЭС) представляет собой однослойный пигментированный эпителий, расположенный между фоторецепторными клетками сетчатки и сосудистой оболочкой глаза. ПЭС играет ключевую роль в цитофизиологических процессах в фоторецепторных клетках, включая постоянный фагоцитоз окончаний наружных сегментов фоторецепторов. Дегенерация ПЭС, которая наблюдается при таких заболеваниях как возрастная макулярная дегенерация и пигментный ретинит, приводит к гибели фоторецепторных клеток и, как следствие, значительному ухудшению зрения. В настоящее время нет эффективных методов лечения данных видов заболеваний. Следовательно существует острая необходимость в поиске новых путей для стимуляции репарации ПЭС.

В процессе эмбрионального развития сетчатка, включая ПЭС, формируется из нервной трубки путем образования парных выпячиваний мозгового пузыря («глазные пузырьки»), сохраняющих связь с эмбриональным мозгом при помощи «глазных стебельков». В результате инвагинации передней части пузырьков образуются двухслойные структуры, получивших обозначение «глазные бокалы». В дальнейшем внутренняя стенка глазного бокала преобразуется в нейральную часть сетчатки, тогда наружный слой дает начало ПЭС. Клетки-предшественницы ПЭС быстро дифференцируются и теряют способность к пролиферации. Уже к 32-50 дню постнатального развития человека ПЭС представляет собой полностью дифференцированный пигментированный однослойный эпителий, в котором больше не наблюдается митозов на протяжении всей жизни [1].

В области ресничного тела сетчатка редуцирована и состоит из двух слоев эпителия (цилиарный эпителий, ЦЭ). Наружная часть ЦЭ представлена пигментированными клетками и, по сути, является продолжением ПЭС. Непигментированная часть ЦЭ представляет собой переднее выпячивание нейрального слоя сетчатки, в которой не происходит дифференцировки нейральных элементов. В 2000 году V. Tropepe и соавт. обнаружили, что клетки цилиарного эпителия мышей в определённых условиях культивирования могут формировать клоногенные сферы (ЦЭ-сферы) [2]. В клетках ЦЭ-сфер выявлялся высокий уровень экспрессии меланина и нестина. При диссоциации первичных сфер и повторном внесении клеток в среду для культивирования они формировали вторичные сферы. При индукции дифференцировки в клетках ЦЭ-сфер активировалась транскрипция генов, экспрессия которых характерна для палочек сетчатки глаза, биполярных нейронов и клеток Мюллера. Позднее аналогичные результаты были получены и для клеток ЦЭ человека [3]. На основании этих данных было выдвинуто предположение, что формирующие сферы клетки ЦЭ млекопитающих являются стволовыми клетками сетчатки, использование которых перспективно при лечении целого ряда заболеваний, при которых наблюдается дегенерация сетчатки.

Однако в исследованиях M. Dyer и соавт., результаты которых были опубликованы в PNAS в 2009 году, было показано, что все клетки ЦЭ-сфер имеют молекулярные, клеточные и морфологические характеристики дифференцированных пигментных клеток ЦЭи [4]. При культивировании с определенными факторами роста они могли экспрессировать нестин и небольшие количества пан-нейрональных маркеров, таких как β-тубули-III. Однако, несмотря на аберрантную экспрессию нейрональных маркеров, они сохраняли морфологию пигментных клеток ЦЭ и не дифференцировались в производные нейрональной сетчатки in vitro и in vivo. Таким образом, существование стволовых клеток в сетчатке глаза было подвергнуто сомнению.

В новом исследовании, проведенном группой S. Temple из NeuralStemCellInstitute и опубликованном в CellStemCell, было показано, что ПЭС содержит субпопуляцию мультипотентных стволовых клеток (СК ПЭС), способных к самообновлению и дифференцировке в клетки нейрального и мезенхимального ряда.

Авторы показали, что, несмотря на то, что клетки ПЭС человека не делятся in vivo, они хорошо адгезируются к пластику и быстро пролиферируют in vitro вплоть до 6-8 пассажа,  при этом время удвоения популяции в среднем составляло 2 дня. Клетки ПЭС активно делились, даже когда возраст донора составлял 99 лет, при этом для стимуляции пролиферации было достаточно только лишь сыворотки. При формировании конфлюэнтного слоя пролиферация фактически прекращалась. В культивируемых клетках наблюдалась экспрессия специфичных для ПЭС генов.

Для тестирования клоногенных свойств использовались специальные условия культивирования: клетки ПЭС полностью диссоциировались; засевались в очень низкой плотности; культивировались в посуде, не поддерживающей адгезию клеток, с использованием заменителя сыворотки и фактора роста фибробластов (FGF2). В таких условиях культивирования, уже через 4 дня наблюдалось формирование сфер, количество которых составляло около 1,5% от числа изначально вводимых клеток. Клетки первичных сфер формировали вторичные, а затем и третичные сферы при пассировании, что свидетельствовало о самообновлении клеток в условиях, не поддерживающих их адгезию. Клоногенный потенциал клеток ПЭС исследовался и при культивировании в условиях, поддерживающих адгезию клеток. Для этого клетки ПЭС полностью диссоциировались и засевались в плашки Терасаки с плотностью 1 клетка на лунку. В таких условиях большинство клеток не пролиферировало. Тем не менее, в 10% лунок наблюдался активный рост и формирование конфлюэнтного слоя клеток. Эти клетки вновь диссоциировались и вносились в плашки Терасаки с плотностью 1 клетка на лунку. Приблизительно в 26% лунок опять же наблюдались активный рост и формирование конфлюэнтного слоя клеток.

Для исследования потенциала к дифференцировке монослои клеток ПЭС культивировались в течение 4 недель в нейрогенной, адипогенной, хондрогенной и остеогенной средах. Клетки полностью дифференцировались и экспрессировали специфические маркеры  всех перечисленных клеточных типов, что было показано с помощью гистохимического и иммуногистохимического окрашивания, а также ПЦР в реальном времени. При культивировании в условиях, стимулирующих нейрональную дифференцировку, в клетках ПЭС наблюдалось 1000-кратное увеличение экспрессии нестина и 90-кратное  β-тубулина-III, в то время как характерная для ПЭС транскрипция гена MITF подавлялась. В отличие от нейрального и мезенхимального направлений дифференцировки, клетки ПЭС не давали производных энтодермы при культивировании в соответствующих условиях. На основании этих in vitro экспериментов авторы сделали заключение, что ПЭС содержит субпопуляцию стволовых клеток и эти клетки способны дифференцироваться в производные двух зародышевых листков – экто- и мезодермы.

Для исключения контаминации клеток ПЭС в культуре клетками мезенхимального происхождения, наличие которых может являться альтернативным объяснением выявленных выше фактов, авторы исследовали мультипотентность индивидуальных клеток, которые подвергались клональной экспансии. В этих экспериментах опять же было показано, что клетки клонов способны к длительному самообновлению и обладают потенциалом к дифференцировке в производные двух зародышевых листков (экто- и мезодермы) in vitro.

Для проверки гипотезы о мультипотентности in vivo, меченные GFP клетки ПЭС помещались на хориоаллонтоисные мембраны цыплят. Через 7 недель в месте введения наблюдался рост клеточных конгломератов. Иммуногистохимическое окрашивание показало, что большинство позитивных по GFP клеток экспрессировали фактор транскрипции Runx2, играющий ключевую роль в остеогенной дифференцировке клеток, и специфический маркер гладкомышечных клеток SMA.Следовательно, клетки ПЭС могут дифференцироваться в мезенхимальные производные in vivo.

Таким образом, в данном исследовании авторы показали, что в определенных условиях некоторые клетки ПЭС могут проявлять себя in vitro, как мультипотентные стволовые клетки. Они способны к самообновлению, что было показано in vitro (выраженный клоногенный потенциал), и, что стало неожиданностью для ученых, к дифференцировке в производные двух зародышевых листков (экто- и мезодермы), что было показано in vitro и частью in  vivo. На основании этих данных, авторы предположили, что эти клетки могут принимать непосредственное участие в патогенезе таких заболеваний глаз, как пролиферативная витреоретинопатия, хориоидальные остеомы и др., при которых наблюдается патологическая пролиферация клеток мезенхимального ряда.

Учитывая высокий потенциал к пролиферации invitro, клетки ПЭС могут стать хорошим ресурсом для заместительной клеточной терапии таких заболеваний глаз, как возрастная макулярная дегенерация и болезнь Штаргардта. Следует отметить, что компанией AdvancedCellTechnology в июле 2011 года уже инициировано клиническое исследование, в котором анализируется лечебный потенциал клеток ПЭС, полученных invitro при дифференцировке аллогенных ЭСК. Кроме того, японские исследователи из центра RIKEN в 2013 году планируют начать первое в мире клиническое исследование с использованием клеток ПЭС, полученных invitro при дифференцировке аутогенных иПС-клеток. 

По материалам:

Salero E., Blenkinsop T.A., Corneo B. et al. Adult Human RPE Can Be Activated into a Multipotent Stem Cell that Produces Mesenchymal Derivatives. Cell Stem Cell. 2012;10(1):88-95.

Литература:

1. Rapaport, D.H., Rakic, P., Yasamura, D.,LaVail, M.M. Genesis of the retinal pigment epithelium in the macaque monkey. J Comp Neurol. 1995; 363:359–76.

2. Tropepe V., Coles B.L., Chiasson B.J.et al. Retinal  stem  cells  in  the  adult  mammalian  eye.  Science. 2000;287:2032–36.

3. Coles B.L., Angénieux B., Inoue T. et al. Facile isolation and the characterization of human retinal stem cells. PNAS USA. 2004;101:15772–7.

4. Cicero S. A., Johnson D., Reyntjens S. et al. Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells. PNAS. 2009;106:6685—90.