Наследственная X-сцепленная форма адренолейкодистрофии (АЛД) представляет собой фатальное демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы (ЦНС), причиной которого являются мутации в гене ABCD1, кодирующем белок-транспортер ALDP, локализованный в мембранах пероксисом [1]. В пероксисомах олигодендроцитов и клеток микроглии этот белок участвует в транспорте эфиров длинноцепочечных жирных кислот (ДЦЖК; более 22 атомов углерода в алифатическом «хвосте»), что необходимо для миелинизации нервных волокон [2]. В результате мутации развивается мультифокальный демиелинизирующий процесс, который приводит к гибели больного, как правило, еще в подростковом возрасте.
Единственным способом излечить это врожденное заболевание является аллогенная трансплантация гемопоэтических клеток. Успех подобной терапии может быть достигнут только на ранних стадиях болезни и при наличии подходящего донора [3]. Поскольку микроглиальные клетки имеют миелоидное происхождение, полагают, что замещение мутантных гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников реципиента «здоровыми» клетками донора позволяет в итоге восстановить процесс миелинизации нервных волокон в ЦНС. Действительно, было показано, что костномозговые клетки человека, трансплантированные мышам, мигрируют в головной мозг и дифференцируются в микроглиальные клетки, экспрессирующие ALDP [4].
Долгосрочные результаты клинического испытания по применению трансплантации генетически «исправленных» аутологичных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), проведенной двум пациентам с АЛД, были опубликованы в журнале «Science». Несомненно, эта работа стала кульминацией продолжительных исследований д-ра Натали Картье (Nathalie Cartier; INSERM) и проф. педиатрии Патрика Эбера (Patrick Aubourg; INSERM и госпиталь Сент-Винсент де Поля) [5]. У обоих пациентов (возраст 7,5 и 7 лет) были обнаружены мутации в гене ABCD1. Несмотря на прогрессирующую демиелинизацию и недостаточность функции надпочечников, отсутствие совместимого донора не позволяло проведение аллогенной трансплантации.
После процедуры G-CSF-индуцированной мобилизации CD34+ клетки были выделены с помощью иммуномагнитной сепарации. Для генетической коррекции клеток пациентов использовали лентивирусный вектор на основе ВИЧ-1, содержащий интактную копию гена ABCD1. В результате трансдукции 50% и 33% трансплантированных CD34+ клеток экспрессировали функционально активный белок ALDP, что привело к более, чем двукратному (55% и 68%) снижению в этих клетках уровня ДЦЖК. Инфузию модифицированных CD34+ клеток проводили после процедуры полной миелоабляции (циклофосфамид и бисульфан), что важно для успешного приживления трансплантата, поскольку лентивирусная коррекция не дает трансплантированным клеткам пролиферативного преимущества по сравнению с остаточными, мутантными ГСК. Восстановление гемопоэза у пациентов наступило соответственно на 13-й и 15-й день.
Посттрансплантационный анализ показал, что со временем экспрессия ALDP в мононуклеарных клетках периферической крови постепенно снижается, стабилизируясь на уровне 10% и 15% спустя 30 и 24 месяца после трансплантации (соответственно для 1-го и 2-го пациентов). Разные популяции клеток крови экспрессировали примерно одинаковое количество ALDP (9–14%), уровень экспрессии ALDP в CD34+ клетках был выше, около 18%.
Поскольку места геномной интеграции вектора представляют собой высоко специфичный маркер для анализа отдельных клеточных клонов, авторы работы провели детальное исследование репертуара инсерционных сайтов (ИС) с помощью амплификации уникальных геномных последовательностей, фланкирующих интегрированный вектор (LAM-PCR — полимеразная цепная реакция, опосредованная линейной амплификацией) [6], и последующего секвенирования полученного ампликона. Было обнаружено 2217 и 1380 уникальных ИС, большая доля которых располагалась в областях, богатых генами. Этот подход позволил выявить 1,4% и 4,6% ИС, присутствующих, как в лимфоидных, так и в миелоидных клетках. Это означает, что вектор был интегрирован в истинные ГСК, способные давать начало клеткам обеих ветвей гемопоэза. Кроме того, количественный анализ ИС показал, что клональный репертуар распределен равномерно: не было обнаружено таких ИС, интеграция вектора, в которые приводила бы к активной пролиферации клона и клональному доминированию.
Спустя 14–16 месяцев после трансплантации у пациентов прекратилась прогрессирующая демиелинизация пирамидального тракта, фронтального белого вещества и других пораженных зон головного мозга. Это сопровождалось стабилизацией нейрологических и когнитивных функций и снижением уровня ДЦЖК в плазме на 38–39%. Важно отметить, что коррекция уровня ДЦЖК оказалась значительно больше ожидаемой, поскольку функционально полноценный ALDP экспрессировало лишь 14% моноцитов.
Успешные результаты этого клинического испытания во многом обусловлены верным выбором вектора для генетической коррекции CD34+ клеток. Сокращенный протокол для трандукции и стабильная экспрессия трансгена несмотря на отсутствие клонального доминирования у трансдуцированных клеток — несомненно, важные преимущества использованного лентивирусного вектора на основе ВИЧ-1. Кроме того, данный вектор содержит инактивирующийся промотер/энхансер длинных терминальных повторов (LTR), что предотвращает генотоксические эффекты, обусловленные транскрипционно активными LTR [7], а значит, снижает вероятность онкотрансформации модифицированных клеток.
Главным — и неожиданным — выводом из этой работы явилось то, что стабильная экспрессия ALDP лишь в примерно 15 % CD14+ моноцитов достаточна для купирования демиелинизирующего процесса и нейрологических нарушений у пациентов. Это кардинально отличается от результатов аллогенной трансплантации ГСК у больных АЛД, где блокада прогрессирующей демиелинизации в головном мозге наблюдалась только при более чем 80%-ом приживлении донорских кроветворных клеток [3]. Авторы полагают, что такая разница может быть обусловлена выраженной экспрессией белка ALDP в генетически модифицированных микроглиальных клетках, что позволяет купировать демиелинизацию нервной ткани.
После длительного периода неудач и скептицизма прошедший год можно, несомненно, обозначить как год возвращения генной терапии в ряды перспективных подходов для лечения наследственных заболеваний [8]. Этот факт был однозначно подчеркнут журналом «Science» при традиционном ежегодном отборе наиболее значимых событий в сфере науки [9]. Так, успешные долгосрочные результаты также были получены при лечении аутосомно-рецессивной формы тяжелого комбинированного иммунодефицита (дефицит аденозиндезаминазы) [10] и амавроза Лебера (врожденная дистрофия сетчатки глаза) [11]. Клинические испытания с привлечением большего числа пациентов должны в дальнейшем определить судьбу генной терапии этих наследственных заболеваний.
По материалам: