Более двух десятилетий исследователи и клиницисты пытаются разработать метод лечения, который гарантировал бы эффективное восстановление кожных покровов пациентам, получившим тяжелые ожоговые и травматические повреждения либо страдающим трофическими язвами различной этиологии. На сегодняшний день наиболее эффективной является операция аутотрансплантации кожи. В перспективе, на смену ей может придти аутотрансплантация выделенных из биоптатов неповрежденных участков кожи и размноженных в культурах in vitro клеток-предшественниц кератиноцитов на трехмерных матриксах [1]. Главным недостатком этого подхода остается то, что на экспансию кератиноцитов в культурах in vitro перед трансплантацией требуется около 3 недель [2]. В течение всего этого времени пациент подвергается риску инфицирования и обезвоживания открытой ожоговой раны. Недели перед проведением аутотрансплантации остаются тем критическим периодом, в котором необходимо обеспечить максимальную защиту поврежденных покровов. В качестве временного покрова возможно использование децеллюляризованного трупного кожного лоскута, однако доступность подобного материала ограниченна, а его применение нередко приводит к развитию реакций воспаления.
Чтобы избежать применения временных трансплантатов и операций аутотрансплантации, предпринимается множество попыток разработки «эквивалентов кожи» на основе инертных синтетических и тканеинженерных матриксов, обычно содержащих коллаген I типа и аллогенные клетки (дермальные фибробласты и реже – фибробласты и кератиноциты) [3]. Однако до настоящего времени ни один из этих продуктов не продемонстрировал высокой эффективности в лечении пациентов с обширными глубокими ожогами [4].
Использование эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека могло бы стать решением проблемы создания эквивалентов кожи, пригодных для трансплантации, позволив получать необходимые типы клеток (дермальные фибробласты и кератиноциты) в неограниченном количестве. Основным препятствием использования данного подхода остается недостаточная эффективность протоколов дифференцировки ЭСК в требующиеся типы клеток и потенциальная туморогенность ЭСК [5-7]. Единственная оставшаяся в предназначенной для клинического использования клеточной культуре недифференцированная эмбриональная стволовая клетка теоретически может привести к формированию у реципиента тератомы – опухоли, развивающейся из ЭСК при их трансплантации.
В 2003 г. были впервые получены фрагменты кожи на основе кератиноцитов, дифференцированных из ЭСК мыши [8]. С тех пор предпринималось множество попыток разработки протокола дифференцировки ЭСК человека в кератиноциты, однако полученные клетки по неясным причинам не были способны к активной пролиферации [9]. Основная задача этих исследований – создание функционального стратифицированного эпидермиса с базальным слоем, содержащим малодифференцированные клетки-предшественницы кератиноцитов, – до настоящего времени так и не была решена [9-11].
В журнале The Lancet были опубликованы результаты работы научной группы, возглавляемой профессором C. Baldeschi. Исследователям впервые удалось получить эквиваленты кожи, аналогичные по своей структуре нормальной коже человека. В своей работе ученые создали протокол дифференцировки, моделирующий длительный многоступенчатый процесс дифференцировки клеток внутренней клеточной массы бластоцисты в базальные кератиноциты эмбриона. Ключевым звеном этого протокола оказалось время, в течение которого клетки культивировали в среде, содержащей индукторы дифференцировки. Интересно отметить, что до этого ученые многие годы не обращали внимания на временные параметры, сосредоточившись на разнообразных химических индукторах дифференцировки [9-12].
ЭСК человека линий Н9 и SA01 культивировали на фидерном слое инактивированных эмбриональных фибробластов мыши в течение 40 суток в питательной среде, содержащей 0,5 ммоль/л BMP4 (bone morphogenetic protein 4) и 0,3 ммоль/л аскорбиновой кислоты. В течение первых 20 суток культивирования в клетках постепенно снижалась экспрессия эмбриональных маркеров Oct4 и Nanog, а к 40 суткам прекращалась экспрессия маркера SSEA3, что было подтверждено количественным ПЦР-анализом, флуоресцентно-активированным клеточным сортингом (FACS) и методом иммуноцитохимии. Параллельно с утратой эмбриональных маркеров в ЭСК происходила последовательность молекулярных событий, аналогичная происходящей в клетках развивающихся эмбриональных покровов [13-15]. В течение первых 10 суток нарастала продукция кератинов 8 и 18, после чего она начинала снижаться, сменяясь продукцией кератинов 5, 14 и 18. К 40 суткам в клетках активно продуцировались кератины 5 и 14, а экспрессия кератина 18 прекращалась. В контрольных культурах нормальных базальных кератиноцитов человека наблюдался аналогичный паттерн экспрессии кератинов, более того, в базальных кератиноцитах и кератиноцитах, полученных из ЭСК (К-ЭСК), совпадала и внутриклеточная локализация данных маркеров. Единственное отличие двух типов клеток заключалось в том, что в К-ЭСК не было отмечены экспрессии антигенов HLA-ABC и HLA-DR.
Эффективность дифференцировки в базальные кератиноциты была одинаковой для обеих использованных линий ЭСК и составляла около 95%. После селекции клетки были высеяны на фибриновый матрикс, заселенный дермальными фибробластами человека. После того, как монослой К-ЭСК на поверхности матрикса достигал конфлюэнтности, полученные «кожные» лоскуты трансплантировали мышам с иммунодефицитом (nu/nu, n=5). Через 10-12 недель после трансплантации образцы ткани фиксировали и оценивали иммуногистохимическим методом на присутствие специфических маркеров дифференцировки кератиноцитов. Следует отметить, что ни у одного из животных не было выявлено развития опухолей.
Было показано, что К-ЭСК формируют нормальный стратифицированный эпителий. В базальном слое наблюдали экспрессию кератинов 5 и 14, интегринов α6 и β4, коллагена VII типа и ламинина 5. В слоях, лежащих над базальным, обнаруживался кератин 10, а инволюкрин и филаггрин – маркеры терминальной дифференцировки кератиноцитов, – продуцировались только в верхних слоях эпидермиса. Структура и плотность образовавшихся покровов также повторяла структуру и плотность нормальной кожи человека. При этом в базальном слое происходила пролиферация клеток, что было подтверждено иммуногистохимической реакцией на маркер Ki-67. Таким образом, полученная искусственная кожа была способна к обновлению.
Авторы этой работы уверены, что полученные ими эквиваленты кожи в будущем могут успешно применяться в качестве временных покровов, защищающих открытые раны перед предстоящей аутотрансплантацией. Возможно, они также смогут стать полноценной заменой аутотрансплантатов. Самоподдерживающиеся линии ЭСК решат проблему доступности материала, а низкая экспрессия молекул HLA на мембране полученных К-ЭСК должна свести к минимуму вероятность развития иммунных реакций при использовании трансплантата.
Выполненных на сегодняшний день экспериментов недостаточно для внедрения полученного продукта в клиническую практику. Для подтверждения безопасности использования искусственной кожи на основе К-ЭСК необходимо проведение расширенных доклинических испытаний на большем количестве экспериментальных животных, доказательство геномной стабильности и всесторонняя характеристика К-ЭСК. Тем не менее, данная работа – первое доказательство возможности получения чистых культур базальных кератиноцитов из ЭСК человека. Более того, это исследование является первым принципиально новым шагом в разработке разнообразных тканеинженерных эквивалентов кожи человека, история которых насчитывает уже более 20 лет [16].
По материалам: