История трансплантации печени (ТП) начинается в 1955 г., когда Сhris Welch совершил первую успешную операцию на собаках [1]. В клинической медицине пионером в этой области выступил Thomas Starzl в 1963 г. [2]. Несмотря на то, что изначально выживаемость больных после ТП была очень низкой (в 70-е годы выживаемость в течение года составляла 25% [3]), ежегодно число выполненных операций значительно растет, и на начало XXI века проводилось около 8000 операций в год [4]. Помимо ежегодного прироста количественного показателя, значимые успехи достигнуты и в плане эффективности операции: выживаемость в течение первых пяти лет составляет более 80% [5], а в течение восемнадцати лет - 48% [6]. Одной из значимых причин подобного улучшения является использование иммуносупрессивной терапии, которая в современном виде начинается как трёхкомпонентная (циклоспорин А, преднизолон и один из следующих препаратов: азатиоприн, деклизумаб, мофетила микофенолат, базиликсимаб), с последующим переходом на двух- (циклоспорин А и преднизолон) или однокомпонентную схему (циклоспорин А) [3, 5, 7]. Иммунносупрессивная терапия резко уменьшила частоту отторжения трансплантата, но увеличила частоту рецидивов вирусного гепатита C (HVC) [8] и гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) [9], в то время как эти заболевания являются одними из наиболее частых причин ТП [10].
Таким образом, мы приходим к ситуации, в которой нам нужно на фоне иммуносупрессорной терапии увеличить эффективность иммунного ответа против HCV и ГЦК.
В направлении пассивной иммунизации моноклональными антителами в наибольшей степени продвинулись исследователи Massachusetts Biologic Laboratories (University of Massachusetts Medical School), приступившие к первой фазе клинических испытаний терапевтического моноклонального антитела MBL–HCV1, показавшего высокую эффективность в исследованиях на шимпанзе [11]. В направлении, подразумевающем усиление клеточного иммунитета, значительный интерес представляет работа группы учёных из Tokyo Medical and Dental University под руководством профессора Hideki Ohdan, опубликованная в The Journal of Clinical Investigation.
В статье приводится комплексное исследование нового метода адоптивной иммунотерапии (АИТ), основанного на введении реципиентам ТП лимфоцитов, полученных при перфузии нормальной печени донора и культивируемых в среде, обработанной IL-2 и OKT3 (коммерческое название мышиных моноклональных антител против CD3 производства Orthoclone), проведённое на культуре гепатоцитов, на мышах, химеризированных гепатоцитами человека и, на заключительной стадии, в клинике Tokyo Medical and Dental University.
Стимулом к данной работе послужило, с одной стороны, нарастание титра RNA HCV в сыворотке ко второй неделе после трансплантации [12] и частые рецидивы HCV [8] и ГЦК [9], и, с другой стороны, большое количество и широкий спектр печёночных лимфоцитов (ПЛ) (в том числе и нетипичных для циркулирующих в крови по рецепторному аппарату, с преимущественно иммуносупрессивной функцией) [13] и большая цитотоксическая активность натуральных киллеров (NK) против ГЦК у ПЛ по сравнению с лимфоцитами крови [14].
В настоящей работе использовались ПЛ, полученные при портальной перфузии печени. Полученные таким образом клетки культивировались в течение 3 сут. в среде, содержащей 5% CO2 при 37°C. В среду добавляли человеческий рекомбинантый IL–2; Takeda) и OKT3. OKT3 добавляли к культуре за 1 сут. до использования.
При ко-культивированнии ПЛ с гепатоцитами, реплицирующими HCV, были получены следующие результаты: ЛП, не культивировавшиеся с IL–2 и OKT3, подавляли репликацию вируса в гепатоцитах, но в гораздо меньшей степени, чем ЛП, культивируемые в среде, с добавлением IL–2 + OKT3. При культивировании только с одним из компонентов, эффективность противовирусного эффекта так же снижалась относительно обработки обоими компонентами, при этом эффект от использования исключительно OKT3 был выше, чем эффект от использования исключительно IL–2 (рис.). Так же были описаны эффекты IL–2 и OKT3на цитотоксичность различных лимфоцитарных фракций: при использовании одного IL–2 противовирусная активность CD56+ фракции была значимо выше, чем активность CD56–, CD3+ (T-лимфоциты), при этом активность CD56+, CD3– (NK) была эквивалентна активности CD56+, CD3+ (NKT). При использовании IL–2 и OKT3 заметно возрастала активность как CD56+, так и CD56– фракции. Все группы лимфоцитов, индуцированных IL–2, активно синтезировали IFNγ. Введение блокирующих IFNγ антител снижало противовирусный эффект. Таким образом, можно сказать, что противовирусная активность ЛП, культивируемых с IL–2 и OKT3, хотя бы частично связанна с IFNγ.
Следующим этапом была апробация АИТ на мышах, химеризированных гепатоцитами человека. Химеризированные мыши (ХМ) были получены по авторской методике, позволяющей практически полностью заменить мышиные гепатоциты человеческими. В данной методике использовались ранее известные uPA (urokinase plasminogen activator, мыши, нокаутные по гену урокиназы, являющейся прямым активатором плазминогена) и SCID (Severe combined immunodeficiency, тяжелый комбинированный иммунодефицит). Как было показано ранее, эти ХМ могут быть заражены HCV и служить моделью для оценки препаратов направленных против HCV [15]. В настоящем исследовании ХМ заражались HCV путём введения 50 μl сыворотки больного человека. АИТ проводилась через 2 нед. после заражения. Введение рекомбинантного IFN-γ так же оказывало подавляющий эффект на развитие инфекции. Эффект АИТ, равно как и эффект рекомбинантного IFN-γ, подавлялся при введении ХМ антител против IFNγ. При проведении АИТ или введение IFN-γ спустя 4 недели после заражения(к этому времени титр RNA HCV достигал уровня 103/мл), профилактический эффект данных процедур не выявлялся. Во всех случаях, кода удавалось предотвратить развитие инфекции, в крови ХМ наблюдался постоянный уровень человеческого альбумина, что свидетельствует об отсутствии негативного влияния АИТ и рекомбинантного IFNγ на человеческие гепатоциты.
После этого АИТ была проведена 14 больным, которым была проведена ТП по поводу ГЦК. 7 из 14 больных имели хронический HCV, у пятерых были положительные Миланские критерии (критерии для проведения трансплантации печени у больных с ГЦК). С целью профилактики рецидива ГЦК пациенты получали предлагаемую АИТ в виде однократной внутривенной инъекции в дозе 2–5×108 клеток. Ни в одном случае не наблюдалось рецидивов ГЦК, в крови перенесших ТП в сочетании с ОИТ отмечалось увеличение цитотоксических лимфоцитов, тропных к ГЦК клона HepG2. Так же изменялось соотношение NK/NKT и возрастала доля NK, положительных по TRAIL (tumor necrosis factor–related apoptosis-inducing ligand, фактор индуцированного апоптоза опухоли). Отмечалась статистически значимая корреляция между количеством TRAIL + NK и цитотоксической активностью против ГЦК.
При оценке противовирусной активности данной АИТ, авторы получили следующие результаты: у всех пациентов, как получавших, так не получавших АИТ, отмечалось снижение титра HCV RNA в первый день после ТП и повышение к концу первой недели после операции до значений, превышающих исходный уровень. В то же время у двух пациентов, получавших АИТ, удалось полностью устранить виремию. При этом у одного из них удалось обнаружить вирусную RNA спустя 2 месяца после операции, а у другого не удалось обнаружить и спустя 20 месяцев. В тоже время у двух пациентов, имевших наибольший титр HCV RNA до ТП, вообще не было ответа на АИТ. Спустя четыре недели после ТП, у 4 пациентов, получавших АИТ, содержание вирусной RNA в крови было ниже определяемого порога или отсутствовало вовсе, а у 3 определялось методом ПЦР. Уровень АЛТ в крови обеих групп был одинаков, что позволило предположить, что АИТ не препятствует репликации HCV, а поражает инфицированные гепатоциты.
Настоящая работа, бесспорно, представляет высокий интерес, как в теоретическом, так и в практическом смысле. Исследование, проведённое на культуре гепатоцитов и на химеризированных мышах приоткрывает новые грани механизмов иммунной защиты против гепатоцеллюлярной карциномы и вируса гепатита C и делает обоснованным клиническое испытание данной работы. В то же время, в клинической части работы смущает маленькая выборка (всего 14 пациентов, из них только 7 инфицированы HCV). А связи с этим получаются практически равные группы в случае определения вирусной RNA через четыре недели после трансплантации печени (4 пациента не имеют RNA HCV в достаточном для определения количестве, 3 имеют) и в случае оценки реакции на ИТ в отдалённой перспективе (2 пациента не отвечали на иммунотерапию, 3 отвечали умерено и 2 не имели определяемого уровня RNA HCV в крови). Таким образом, работа смотрелась бы более целостно без раздела, посвящённого клиническим испытаниям, которые, к тому же, не завершены в настоящий момент.
По материалам :