Процесс перепрограммирования соматических клеток в плюрипотентные in vitro является достаточно сложным для изучения. Наиболее проблематично оценить количественные характеристики и временные рамки происходящих критических событий. Причиной этого является клеточная и генетическая гетерогенность полученных de novo трансформированных соматических клеток. Для того, чтобы обойти необходимость вирусной трансдукции и уменьшить гетерогенность экспрессии перепрограмирующих факторов, была изобретена «вторичная» перепрограммирующая трансгенная система, в которой все соматические клетки обладают одинаковым паттерном интеграции препарат-индуцируемых вирусных трансгенов Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc [1-3].
Используя эту систему на клетках линии В-лимфоцитов Nanog-GFP репортерных мышей, коллектив исследователей из Whitehead Institute for Biomedical Research и Massachusetts Institute of Technology взялся решить ряд актуальных вопросов эпигенетики:
- как происходит развитие процесса перепрограмирования генетической системы клеток в течение времени и что происходит с преобладающим количеством клеток, которые не становятся перепрограммированными в течение продолжительных клеточных делений на фоне экспрессии перепрограммирующих факторов?
- за счет чего некоторые соматические клетки, обошедшие механизмы клеточного старения и апоптоза в результате экспрессии Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc превращаются в индуцированные плюрипотентные стволовые (iPS) клетки раньше других?
- все ли взрослые донорские клетки, экспрессирующие факторы Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc, в конечном счете, станут iPS-клетками, или это может быть достигнуто за счет дополнительных генетических или молекулярных манипуляций?
- ограничена ли высокая перепрограммирующая способность только для клеток, не принадлежащих к каким-либо линиям дифференцировки, и взрослым стволовым клеткам?
Авторы исследовали характеристики процесса перепрограммирования путем изменения генетической программы клеток. Было использовано индуцированное выключение ряда генов с помощью метода коротких интерференционных РНК. В ходе экспериментов проводился постоянный контроль экспрессии факторов Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc. Генами-мишенями для выключения были выбраны p53 и p21. Белок р21, который является основной эффекторной мишенью p53, регулирует прогрессию клеточного цикла и является ингибитором циклин-зависимых киназ. Также было оценено влияние оверэкспрессии гена Lin28, усиливающего перепрограммирование фибробластов человека и действующего как онкоген, модулирующий экспрессию регуляторов клеточного цикла.
В результате оказалось, что совместное выключение (нокдаун) обоих генов p53 и p21, или оверэкспрессия Lin28 ускоряют процесс перепрограммирования, увеличивая совокупную вероятность скорейшего возникновения стохастических событий. Оказывается, в случае р53/р21 ингибирования задействован механизм, зависимый от уровня пролиферации клеток. Механизм действия белка Lin28 несколько иной – акселерация появления iPS-клеток проявляется за счет более быстрого увеличения клеточной популяции в результате сокращения времени клеточного цикла и ускоренного деления клеток.
Следующим шагом стало исследование влияния на перепрограммирование клеток гена Nanog, являющийся фактором плюрипотентности и экспрессирующийся во время эмбрионального развития в клетках внутренней клеточной массы. Эмбриональные стволовые клетки и iPS-клетки нуждаются в присутствии функциональной эндогенной аллели Nanog [4].
Установлено, что усредненное число клеточных делений до появления iPS-клеток существенно снизилось с 70 у контроля и линий с выключенными генами p53 и p21 до 50 делений у линии с оверэкспрессией Nanog. Такие данные позволяют сделать вывод о том, что оверэкспрессия Nanog ускоряет кинетику перепрограммирования за счет внутриклеточных механизмов, независимых от уровня клеточной пролиферации. Авторы отмечают, что дальнейшее изучение молекулярного механизма, за счет которого белок Nanog управляет системой поддержания плюрипотентности клеток, представляет несомненный интерес.
Следует отметить, что число клеточных делений, необходимых для получения iPS-клеток, не является ключевым параметром при использовании других стратегий перепрограммирования. В случае переноса ядра соматической клетки в яйцеклетку ген Oct4, являющийся маркером плюрипотентности и молчащий в соматическом ядре, реактивируется в течение 1-2 клеточных делений [5-6]. Это свидетельствует о том, что в цитоплазме яйцеклетки содержатся пока неизвестные детерминанты, посредством которых стойкое перепрограммирование достигается за единичные клеточные циклы [7].
В результате исследований оказалось возможным сделать следующие выводы:
1) перепрограммирование соматических клеток в плюрипотентные является стохастическим процессом, при этом практически все соматические клетки имеют возможность стать iPS-клетками при непрерывном делении на фоне экспрессии факторов Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc;
2) хотя перепрограммированные клетки появляются не ранее 8-10 сут. экспрессии Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc [8], время экспозиции в доксициклине (запускающем экспрессию лентивирусного вектора с факторами Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc) и число клеточных делений, прошедших до появления популяции клонов iPS-клеток, сильно варьирует;
3) данные исследования не подтверждают гипотезу «элитных компонентов» для перепрограммирования клеток [9]: большинство, если не все, клетки линии В-лимфоцитов и моноциты с устойчивой экспрессией всех четырех факторов перепрограммирования оказались способны произвести iPS-клетки;
4) соматические клетки перепрогаммируются с реализацией различных латентностей, что не может быть объяснено только разницей в темпе пролиферации и временем экспозиции в доксициклине. Подтверждается участие неопределенных стохастических событий, происходящих во время процесса перепрограммирования клеток.
По материалам: