Детализация возрастных изменений функциональной активности организма на клеточном уровне имеет принципиальное значение для развития клеточных технологий: изменения количественного и качественного состава клеточных популяций, их регенераторных потенций, восприимчивости к регуляторным влияниям и прочие аспекты функционирования должны быть установлены и изучены для эффективного использования клеточного материала в рамках биотехнологического направления. В этой связи, исследования, нацеленные на сравнение различий функциональных особенностей клеток в зависимости от возраста доноров, весьма многочисленны, однако остаются не систематизированными.
Более глобальной причиной активного изучения возрастных изменений, происходящих на тканевом, клеточном и субклеточном уровнях, является установление механизмов старения. В частности, широко известным является факт возрастного ухудшения функционального состояния скелетной мускулатуры, проявляющийся мышечной атрофией и замещением мышечных волокон соединительной тканью, частично обусловленный системными нарушениями (со стороны нервной и сердечно-сосудистой систем) [1], но, по всей видимости, связанный также со снижением активности местных регенераторных процессов.
Согласно наиболее распространенной теории, основным клеточным источником, реализующим процессы физиологической и репаративной регенерации поперечнополосатой мышечной ткани, является популяция миосателлитоцитов, способных к пролиферации и последующей дифференцировке в миобласты, сливающихся в мышечные симпласты [2]. В этой связи, характерные дегенеративные изменения мышечной ткани могут быть обусловлены снижением количества или функциональной активности миосателлитоцитов [3]. Данные о вариабельности их количественного состава крайне противоречивы: одни авторы утверждают о закономерном возрастном снижении численности миосателлитоцитов [4], другие – о практически неизменном их количестве [5]. В части, касающейся закономерного снижения пролиферативных и дифференцировочных потенций миосателлитоцитов, значимых расхождений во мнениях и результатах исследований нет [4-6], но механизмы клеточного и субклеточного уровней в полной мере не определены.
В этой связи, значительный интерес представляют результаты исследования I. Conboy с соавт. (2009), частично раскрывающие молекулярные механизмы, ответственные за возрастное ухудшение функционального состояния скелетной мускулатуры. В работе приняли участие 21 человек (10 возрастом около 22 лет и 11 – со средним возрастом 71 год), которые были разделены по возрастному критерию на две группы. Гипотрофия латеральной широкой мышцы бедра была индуцирована временной иммобилизацией нижних конечностей (в течение 2 нед.), после чего в течение 4 нед. задавалась интенсивная физическая нагрузка. Биопсии из средней части латеральной головки четырехглавой мышцы бедра выполнялись непосредственно перед и после иммобилизации, а также спустя первых 3 сут. восстановительного периода и на момент его окончания через 4 нед.
На первом этапе исследования было показано, что исходно количество мышечных волокон у пожилых людей меньшее, чем у молодых. В ходе индукции гипотрофии дегенерация скелетной мышечной ткани носила более выраженный характер, в периоде восстановления наблюдался постоянный воспалительный процесс и склерозирование, в то время как у лиц возрастом около 22 лет определялась лишь умеренная гипотрофия и быстрое возвращение мышечной ткани к исходному морфофункциональному состоянию. Данные гистологического анализа были сопоставимы с результатами функциональных проб, показавших быстрое восстановление силы и выносливости гипотрофированных мышц до исходного уровня после устранения иммоблизизации в группе молодых людей, в противоположность пожилым.
Рис.: Моменты времени получения биоптатов латеральной головки четырехглавой мышцы бедра у людей 2 групп: молодых и пожилых. Ниже представлена гистологическая картина взятых образцов: у пожилых людей 2 недели иммобилизации приводят к выраженной дегенерации мышечной ткани.
В дальнейшем, чтобы определить ключевые клеточные механизмы, ответственные за возрастное снижение регенеративных потенций поперечно-полосатой мышечной ткани, авторы определяли удельную численность популяции миосателлитоцитов. Клетки идентифицировали определением фактора транскрипции Pax7, М-кадгерина и молекулы адгезии нейральных клеток. Было установлено, что количество миосателлитоцитов в группе пожилых вдвое меньшее, чем в группе молодых людей. Важно, что незначительное увеличение количества этих клеток в течение двух недель иммобилизации сменялось четырехкратным снижением в течение восстановительного периода, что позволило авторам постулировать об ухудшении активации миосателлитоцитов с возрастом в ответ на повреждение/ гипотрофию.
Показав ранее значимость сигнального пути Delta/Notch в индукции регенераторных потенций миосателлитоцитов [7], исследователи определяли уровень экспрессии клетками Notch и одного из его лигандов – Delta. Оказалось, что до иммобилизации их содержание в миосателлитоцитах было низким в обеих группах, однако с началом регенераторных процессов экспрессия в группе молодых людей значительно возрастала, а в случае пожилых – оставалась практически неизменной, что свидетельствует об изменении активности сигнального пути Delta/Notch с возрастом.
Для более детального изучения молекулярных механизмов, снижающих функциональную активность миосателлитоцитов в процессе старения, авторы, показали, что клетки группы пожилых людей характеризуются более высоким уровнем экспрессии трансформирующего фактора-β (TGF-β) и его транскрипционного фактора pSmad3, которые ответственны за снижение продукции Notch. Кроме того, индуцирует повышение экспресии p15 и p21 – ингибиторов циклин-зависимых киназ (cyclin-dependent kinase (CDK)), за счет чего, по всей видимости, снижается пролиферативная активность миосателлитоцитов. Снижение регенераторных потенций миосателлитоцитов, даже полученных от молодых доноров, под действием TGF-β было показано авторами и в эксперименте in vitro при добавлении фактора роста в культуральную среду. При этом инкубирование «старых» миосателлитоцитов в кондиционированной «молодыми» клетками среде приводило к статистически значимому увеличению их пролиферативной активности, а при обратной постановке эксперимента – к снижению регенераторных потенций миосателлитоцитов группы молодых людей.
В заключение, исследователи подтвердили положительное регулирующее влияние митоген-активированной протеинкиназы (mitogen-activated protein kinase, MAPK) на экспрессию, характерную для эмбрионального периода [8]. Внесение в культуральную среду агониста MAPK – фактора роста фибробластов-2, приводило к повышению продукции Delta и Notch и активации пролиферативных потенций клеток, полученных даже от пожилых людей, а введение антагониста – MAPK ингибитора – к снижению Delta и Notch. В подтверждение реализации эффектов сигнального пути MAPK через Notch было показано, что положительное влияние агонистов MAPK на пролиферативную активность миосателлитоцитов нивелируется введением блокатора Notch – ингибитора гамма секретазы (gamma secretase inhibitor). Непосредственное введение в культуральную среду эндогенного Delta также приводило к активации регенераторного ответа миосателлитоцитов группы пожилых людей.
Таким образом, молекулярные механизмы, ответственные за процесс снижения регенераторных потенций миосателлитоцитов с возрастом чрезвычайно сложны. Можно с уверенностью утверждать, что авторы в ходе ряда исследований выявили и обосновали один из них, общий для человека и животных, в который вовлечены MAPK, Delta/Notch, pSmad3/TGF-β, ингибиторы циклин-зависимых киназ, что может найти практическое применение в клеточных технологиях.
По материалам: