Ученые из Великобритании - Остин Смит (Austin Smith) и Ян Чемберс (Ian Chambers) несколько лет плодотворно сотрудничают, исследуя плюрипотентные клетки и, в частности, роль гомеобоксного белка Nanog. Шесть лет назад они вместе с коллегами из Эдинбургского университета впервые охарактеризовали этот транскрипционный фактор [1]. Независимо и одновременно с ними показали особую роль Nanog в эмбриональных стволовых клетках (ЭСК) японские исследователи во главе с Синъя Яманака (Shinya Yamanaka) [2]. И хотя приоритета в открытии Nanog у британцев нет, своим необычным названием этот фактор обязан шотландцу по происхождению Яну Чемберсу. Ян Чемберс назвал его Nanog в честь кельтской мифической земли вечной юности - Tír na nÓg.
Экспрессия Nanog является специфичной для плюрипотентных клеток. Кроме клеток внутренней клеточной массы и эмбриональных стволовых клеток Nanog обнаружен только в развивающихся герминативных тканях млекопитающих. Делеция Nanog приводит к ранней доимплантационной гибели эмбриона, а его сверхэкспрессия в мышиных ЭСК – к автономии от цитокина LIF при культивировании [2]. Согласно устоявшемуся мнению, Nanog наряду с такими факторами, как Oct4 и Sox2, находится в центре транскрипционной сети плюрипотентной клетки [3]. Повышение экспрессии Nanog делает более эффективным перепрограммирование путем слияния ЭСК и нейральных стволовых клеток [4]. Несмотря на это, Nanog не входит в каноническую четверку транскрипционных факторов Oct4, Sox2, c-Myc, и Klf4, трансфекция которыми приводит к перепрограммированию соматических клеток и получению клеток с индуцированной плюрипотентностью (iPS клетки). Некоторым противоречием является и тот факт, что, занимая одно из ключевых мест в иерархии регуляторных генов плюрипотентности, Nanog экспрессируется в ЭСК со значительной вариабельностью - вплоть до полного отсутствия экспрессии в отдельных клетках. Более того, делеция гена Nanog в ЭСК не приводит к переключению к дифференцировке, а лишь к получению линии ЭСК, имеющей повышенную склонность «уходить» в дифференцировку, но в норме обладающих всеми признаками плюрипотентности [5].
В осеннем номере журнала «Cell» опубликованы результаты исследования, проведенного с участием трех первооткрывателей Nanog Остина Смита, Яна Чемберса и Синъя Яманака, уточняющее его роль [6]. Данная работа показывает, что Nanog нужен на финальных стадиях формирования плюрипотентного статуса, когда все остальные ключевые факторы плюрипотентности уже активированы. Экспрессия Nanog равно необходима как в конце процесса получения iPS клеток, так и для формирования пула плюрипотентных клеток в мышином эмбрионе.
Авторы пользуются весьма широким диапазоном методов, из которых наиболее показательным является демонстрация необходимости Nanog для перехода от недифференцированного состояния клеток к плюрипотентности при соматическом перепрограммировании нейральных стволовых (НС) клеток. В своей предыдущей работе авторы разработали метод перепрограммирования НС клеток, в котором наряду с трансфекцией факторами Oct4, Klf4 и c-myc используются ингибиторы двух киназ: митоген-ассоциированной протеин-киназы и GSK-3 киназы [7]. При таком подходе можно разделить процесс индукции плюрипотентности на две стадии. При трансфекции транскрипционными факторами происходит дедифференцировка, но отсутствует реактивация Х-хромосомы в женских клетках, нет устойчивой экспрессии Oct4 и Nanog, нет способности формировать ткани взрослого химерного организма. При последующем вводе в среду ингибиторов вышеуказанных киназ и LIF происходит окончательное приобретение всех признаков плюрипотентной клетки. В текущей работе было использовано две линии клеток: линия НС клеток с делетированным Nanog и эта же линия, в клетки которой введен конститутивно-экспрессирующийся вектор с Nanog. При трансфекции Oct4, Klf4 и c-myc происходила успешная дедифференцировка клеток обоих линий, а введение ингибиторов и LIF приводило к завершению только у экспрессирующей Nanog линии (рис. 1).
Вторая, хотя и не последняя, линия доказательств включала наблюдение за экспрессией Nanog и Oct4, а также статусом X хромосомы между 3 и 5 сут. эмбрионального развития мышиной самки (рис. 2). В этих исследованиях проводили сравнение за развитием эмбрионов с генотипом nanog+/nanog+, nanog+/nanog- и nanog-/nanog-. Как известно, для всех линий ЭСК мыши характерен активный статус обоих хромосом у клеток с кариотипом 40ХХ, а такой статус Х-хромосом является одной из определяющих характеристик клеточной плюрипотентности у самок мышей. В качестве эпигенетического маркера неактивной Х-хромосомы использовали Eed-белок. О наличии молчащей Х-хромосомы свидетельствует присутствие в клеточном ядре яркого фокуса при ИГХ-окрашивании с использованием антител к Eed. До 3.5 сут. развития эмбрионы с различным генотипом не имели различий в морфологии, а во всех клетках выявлялся фокус окрашивания Eed. На 4.5 сут. происходила реактивация Х-хромосомы только в тех эмбрионах, которые имели ген Nanog. Реактивация Х-хромосомы была обнаружена только в тех клетках, которые экспрессируют не только Oct4, но и Nanog, и такие клетки занимают центральное положение во внутренней клеточной массе бластоцисты, т.е. по мнению авторов, соответствуют эпибласту. Эмбрионы nanog-/nanog- имели сниженное количество клеток во внутренней клеточной массе, и у них отсутствовал компартмент эпибласта.
Эти и другие свидетельства, приведенные в статье, говорят о том, что Nanog необходим на окончательной стадии формирования плюрипотентного статуса клеток как при нормальном эмбриональном развитии, так и при соматическом перепрограммировании. При этом экспрессия Nanog не является принципиальной ни на первых этапах становления плюрипотентности, ни по завершении этого процесса. Авторы исследования считают, что Nanog координирует уже существующую активность ключевых генов и белков, заставляя их работать в согласованном режиме, что обуславливает переход к самоподдерживающемуся состоянию плюрипотентности. Аналогией, которой пользуются авторы для описания роли Nanog, является роль дирижера или хореографа. Следующей задачей, которую ставят для себя исследователи, является изучение способа, каким образом Nanog осуществляет подобное управление.
Следует отметить, что приведенные в статье факты относятся только к мыши. Интересно, насколько выводы, сделанные авторами в отношении роли Nanog, приложимы к плюрипотентным клеткам человека. В частности, существуют данные, что в отличие от мышиных клеток добавление Nanog к факторам Oct4, Sox2, c-Myc, и Klf4 повышает эффективность получения iPS клеток человека [8], что может говорить о более раннем участии Nanog в процессе перепрограммирования соматических клеток человека. Как бы то ни было, данная работа не только проясняет функциональную роль Nanog, но и демонстрирует удивительную зеркальность финальных процессов, которые происходят при естественном возникновении плюрипотентных клеток в бластоцисте и при их искусственном получении в виде iPS клеток.
По материалам: