Известно, что гемопоэтическая стволовая клетка (ГСК) является родоночальницей всех форменных элементов крови. Однако, до настоящего времени не удавалось получить полностью зрелые эритроциты из ГСК in vitro и моделировать все стадии эритропоэза. Ранее сообщалось о выделении и характеристике эритроидных предшественников (ЭП) из ГСК [1-3], но не зрелых форм.

Для масштабирования клеток крови из ГСК применяют 2-3-х ступенчатые протоколы культивирования. На первом этапе производят экспансию ГСК кокультивируя их на стромальных линиях или первичных стромальных клетках костного мозга, создавая тем самым комфортное микроокружение и искусственную нишу. В последнее время, исследователи добиваются высокой экспансии и хорошей дифференцировки в условиях бесстромального культивирования, что с одной стороны упрощает протокол, с другой - требует добавления в культуру дополнительных цитокинов. Этап экспансии требует добавления в культуру цитокинов и факторов роста, стимулирующих пролиферацию ГСК (SCF, IL-6, IL-3, TPO, flt3-ligand) без "ухода" в лимфоидную или миелоидную дифференцировку. Задача следующих этапов - стимуляция специфической дифференцировки в "сромальных или беcстромальных" условиях культивирования.

В 2002 году был опубликован первый протокол по крупномасштабному выделению ЭП человека [4]. Группе Neildez-Nguyen удалось добиться более чем 200 000 кратной экспансии ГСК пуповинной крови (CD34+) и выделения ЭП из них с чистотой 95-99%. Однако, клетки становились полностью зрелыми только in vivo, в течение первых 4-х дней после инъекции в NOD/SCID мышей [4].

Новый протокол французской группы, опубликованный в Nature Biotechnology, позволяет добиться крупномасштабного выделения полностью зрелых эритроцитов человека из ГСК in vitro.

CD34+ клетки выделяли из костного мозга, периферической крови (нормальной и мобилизированной G-SCF) здоровых волонтёров и пуповинной крови, методом магнитного сортинга (mini-MACS). Очищенные клетки культивировали в бессывороточных условиях. Производили 3-х ступенчатую экспансию. Первые дни ГСК культивировали в присутствии цитокинов (IL-3, SCF, EPO), стимулирующих преимущественно пролиферацию. Затем масштабированные клетки разводили в большом объёме среды и культивировали на стромальной мышиной линии MS-5 или в присутствии первичных стромальных клеток костного мозга человека в присутствии EPO (эритропоэтина). В заключительной стадии все цитокины отменяли, оставляя "клетки на строме" в течении 10 дней.

Степень экспансии составила в 16 500 раз для ГСК костного мозга и периферической крови, 29 000 - для мобилизированной крови и 140 000 для клеток пуповинной крови. Так, например, из 1 миллиона CD34+ клеток, выделенных их мобилизированной крови получали 30 миллиардов (безядерных) эритроцитов. На 8-й день культивирования 95-98% клеток характеризовались как эритробласты. Количество безядерных клеток возростало с 1-5% на 11 день культивирования до 65-80% - на 15-й день (98% из них были ретикулоцитами). Матурация ретикулоцитов в зрелые эритроциты наблюдалась с 15 по 18 день культивирования. На конечном этапе чистота зрелых эритроцитов в культуре составила 90-100%. Дифференцировку в ЭП подтверждали исследованием характерных колоний - BFU-E (burst forming unit-erythroid) (BFU-E) и CFU-E (colony forming unit-erythroid). Интересно, что способность к экспансии ГСК и ЭП сохранялась и в бесстромальных условиях культивирования, однако при этом утрачивалась финальная матурация ретикулоцитов в зрелые формы. Общее время культивирования составляло 18 дней, за которое расходывалось 10 литров среды.

В предложенной системе был показан процесс нормального синтеза гемоглобина. Так, 95% эритроцитов, выделенных из ГСК костного мозга и периферической крови содержали HbA и около половины из них - HbF. 64% эритроцитов, выделенных из ГСК пуповинной крови содержали фетальный гемоглобин (HbF). Другими признаками функциональной активности послужило подтверждение активности ферментов - фосфат-дегидрогеназы (G6PD) и пируват-киназы (PK) в полученных клетках. Тест на способность фиксировать и освобождать кислород подтвердил полную функциональную зрелость полученных клеток. Показатели "кислородных" тестов были очень близки к контрольным пробам - эритроцитам, взятым от тех же доноров.

Для подтверждения способности к матурации in vivo, NOD/SCID мышам интраперитонеально вводили меченые ретикулоциты, выделенные в in vitro системе. Через 3 дня наблюдали матурацию большинства (>90%) меченых клеток в периферическом кровотоке, подтверждая их человеческое происхождение.

Получение полностью зрелых эритроцитов in vitro позволит изучить эритропоэз в норме и патологии. При предложенном способе масштабирования эритроцитов in vitro, в медицине впервые открывается возможность аутогемотрансфузий аутологичных доз эритромассы. Так одна стандартная доза донорских эритроцитов содержит 2х10 (12) клеток. Из 1 образца пуповинной крови можно выделить 2-5 миллионов CD34+ клеток, а из мобилизированной крови ~ 5 миллионов/кг веса. При показанной исследователями степени экспансии можно получить как минимум 1 полноценную дозу эритромассы. То есть предложенный протокол вполне совместим с клиническими требованиями по количеству эритроцитов для трансфузий. Подобные аутогемотрансфузии могут быть полезны при различных формах анемий и хронических кровопотерях, но не в острых ситуациях. Так, при серповидно-клеточной анемии можно искусственно повысить количество незрелых форм богатых HbF, что возможно, приведёт к коррекции полимеризации гемоглобина и терапевтическому эффекту. Аутоэритроцитарная трансфузия позволит поддерживать срок жизни введённых клеток на уровне 120 дней, в то время как донорские эритроциты способны жить в реципиенте только 28 дней. Теоретически, метод способен совершить революцию в медицине (если "закрыть глаза" на его стоимость) и стать уникальным при высоком риске инфицирования и в стремлении гарантировать безопасную (по HIV, HCV, HBV и т.д.) трансфузию эритроцитов.