Муковисцидоз (МВ) - одно из распространённых (среди представителей европейской расы) аутосомно-рецессивное наследственное заболевание, возникающие в результате мутации гена CFTR (transmembrane conductance regulator), регулирующего транспорт иона хлора через мембрану эпителиальной клетки. При этом усиливается абсорбция натрия и воды и происходит "высушивание" слизи, продуцируемой экзокринными железами. Избыточно вязкий секрет закупоривает протоки, вследствие чего образуются множественные кисты и развивается системная дисфункция экзокринных желёз. МВ является актуальной причиной заболеваемости и смертности (основной причиной которой является прогрессирующая дыхательная недостаточность и присоединение инфекций) среди детей и подростков [1].

За последние несколько лет было предложено несколько протоколов генотерапии МВ, использующей генетические конструкции CFTR [2-4]. Оптимальной терапевтической мишенью для доставки вектора с CFTR считается дыхательный эпителий (ДЭ), однако его трансфекции in vivo препятствует наличие избытка слизи, отсутствие рецептора для вируса на поверхности клетки, быстрая деградация ДНК и плохая интеграция вектора [2-4].

Альтернативный подход к заместительной клеточной генотерапии недавно был предложен группой Wang-Prockop. Идея заключается в применении аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (МСК), трансфецированных конструкцией CFTR, как потенциального источника нового (здорового) дыхательного эпителия лёгких. Подоплёкой к применению МСК для терапии МВ послужили следующие данные:
- указания на возможность дифференцировки (или слияния) МСК в эпителиальные клетки дыхательных путей in vitro и in vivo [5,6,8];
- хорошая миграция МСК в дефектные лёгкие in vivo [7,8];
- неплохая трансфецируемость МСК различными генетическими конструкциями с уверенной экспрессией трансгена [9];
- возможность использования аутологичного материала и экспансия МСК in vitro в миллиард раз за 2 месяца культивирования [10,11].

МСК забирали из крыла подвздошной кости от здоровых волонтёров и от больных МВ. Клетки выделяли и культивировали по протоколу Sekiya-Prokop [10] с масштабированием в системе клеточной фабрики (Nunc). Клетки трансфецировали меткой GFP и трансгеном CFTR с последующей лекарственной селекцией. Для дифференцировки МСК применяли специальную систему кокультивирования с линией дефектного (по CFTR) ДЭ или с первичными клетками, выделенными из лёгких больных МВ. Клетки кокультивировали на границе раздела жидкой и газовой (воздушной) фаз.

Через 2 (и более) недели кокультивирования нормальных МСК и дефектных клеток ДЭ в такой системе, наблюдали появление эпителий-подобных клеток, несущих метку МСК. Кроме того, часть GFP+ (МСК) клеток положительно окрашивалась на эпителиальные маркёры - СК-18 и occludin (~ 10% МСК), чего не наблюдалось в контрольных экспериментах (культивирование МСК в сходных условиях). После кокультивирования наблюдали экспрессию CFTR дикого типа, что подтверждали методом RT-PCR отсортированных (FACS) GFP+ клеток. То есть, часть МСК от здоровых доноров при кокультивировании подвергалась трансдифференцировке в клетки ДЭ. Феномен слияния исключали отсутствием клеток, положительно окрашивающихся одновременно как по метке МСК - GFP, так и по метке ДЭ - RFP.

Для оценки клинического потенциала метода выделяли МСК от МВ - гомозигот. Клетки больных МВ имели одинаковую (со здоровыми) способность к экспансии in vitro и дифференцировке в мезенхимальные ткани (костную и жировую). Дефектные МСК трансфецировали CFTR. Было показано, что генетическая коррекция МСК не влияла на их способность к делению, образованию колоний и способности к дифференцировке в мезенхимальные ткани, по сравнению клетками до трансфекции и нормальными МСК от здоровых доноров. Устойчивость экспрессии CFTR подтверждали методом RT-PCR. Наконец, при кокультивировании дефектных, трансфецированных CFTR МСК (от больных МВ) с дефектной линией ДЭ, через месяц наблюдали восстановление секреции аниона хлора (по радиактивной метке). Как и в физиологичкеских условиях, Cl- секретирвался с апикальной части мембраны клеток в ответ на стимуляцию cAMP. Секреция хлора не зависела от количества МСК (5, 10, 20%) при кокультивирвании с дефектными клетками ДЭ. Оптимальное соотношение кокультуры 1:5 (20% МСК).

Таким образом, предложен новый оригинальный метод клеточно-генетической коррекции функции ДЭ у больных МВ. Исследование, проведёное на материале пациентов с МВ, продемонстрировало возможность использования аутологичных ген-модифицированных (или немодифицированных) МСК в клинической практике. Однако, до начала клинических испытаний необходимо подтвердить эффективность метода на животных моделях.