iPS-клетки - исторические аспекты..

[Transpl]

      Если Вы считаете, что какие-либо аспекты изложенного ниже материала носят спорный характер или неверны - пожалуйста, выскажите свое мнение по ссылке - Фокус - iPS-клетки - обсуждение..

      При использовании изложенного ниже материала, пожалуйста, ссылайтесь www.celltranspl.ru

Глава 1 - А что было до?
 
    После выделения эмбриональных стволовых клеток из бластоцист сначала у приматов (J.Thomson, 1995г.), а затем и у человека (J.Thomson, 1998г.) открылись реальные перспективы получения неограниченного количества "клеточного материала" для клеточной терапии, тканевой инженерии и других целей. Тем не менее, предложенный метод выделения ЭСК не позволял получить аутологичные линии клеток для каждого индивидуального человека. Перспектива же использования аллогенных ЭСК и их производных оставалась и по сей день остается туманной, что связано, прежде всего, с высокой вероятностью иммунного отторжения. Некоторые исследователи пытались доказать, что аллогенные ЭСК обладают иммунопривилегированными свойствами и не отторгаются при введении (два из таких исследований описаны по ссылке - новость1 и новость2. Однако, в подобных исследованиях были получены противоречивые результаты, в связи с чем ведущие научно-исследовательские лаборатории мира сосредоточились на разработке методов, которые при необходимости позволили бы получить аутологичную линию ЭСК для каждого конкретного человека.     
   
   Выделение ЭСК по предложеному J.Thomson методу производилось из бластоцист (оригинальная статья в приложении) - а где ее взять у взрослого человека? Возникла перспективная идея использовать для получения "индивидуальных" бластоцист (а значит и "индивидуальных" ЭСК) метод переноса ядра соматической клетки (somatic cell nuclear transfer - SCNT) в предварительно энуклеированный овоцит - метод, ранее использованный для успешного клонирования некоторых млекопитающих. Отсюда появился термин "терапевтическое клонирование", который, в противовес репродуктивному клонированию, использовался в случаях, когда SCNT применялся для получения бластоцист, необходимых для выделения "индивидуальных" линий ЭСК. Тем не менее, использование SCNT приминительно к человеку сопряжено с рядом серьезных технических и этических проблем и в настящее время серьезных успехов в этом направлении достигнуто не было.

   Успешное клонирование целого ряда млекопитающих свидетельствует, что перенесенный в яйцеклетку генетический материал под воздействием  неизвестных факторов овоцита претерпевает ряд эпигенетических изменений и приобретает фактически аналогичный генетическому материалу обычной зиготы статус - процесс, который получил название "перепрограммирование". Явление перепрограммирования ядра соматической клетки также было показано при слиянии соматических клеток с ЭСК (описание одного из основополагающих исследований на эту тему для клеток человека - новость).
   Перепрограммирование ядра соматической клетки при переносе в энуклеированную бластоцисту или при слиянии соматической клетки с ЭСК заинтересовало исследователей с точки зрения выявления и использования факторов, содержащихся в овоците и/или ЭСК и обуславливающих эпигенетические изменения.   

[Transpl]

Глава 2 - Первая публикация о получении iPS-клеток - Shinya Yamanaka и Kazutoshi Takahashi

   Шинья Яманака (Shinya Yamanaka) из университета Киото, Япония, один из первых предположил, что, по крайней мере, большая часть факторов, ответственных за перепрограммирование, одновременно являются факторами, обуславливающими самообновление и плюрипотентность ЭСК.
   
   В поле зрения японского ученого попали следущие 24 фактора. Ниже представлено краткое описание наиболее "обоснованных" факторов:
   
      1. Oct3/4 (POU5F1) - фактор транскрипции из семейства POU, специфически экспрессирующийся в ЭСК, клетках эмбриона на ранних этапах развития и в половых клетках. Впервые был описан как Oct3 (Okamoto et al. 1990) и Oct4 (Scholer et al. 1989). Подавление активности Oct3/4 в ЭСК индуцирует быструю дифференцировку в клетки трофобласта.   
      2. Sox2 - транскрипционный фактор из семейства Sox (SRY-related HMG-box), специфично экспрессирующийся в ЭСК, клетках эмбриона на ранних стадиях развития, в половых клетках и нейральных стволовых клетках. Подавление активности Sox2 в ЭСК индуцирует быструю дифференцировку  (Ivanova et al. 2006; Masui et al. 2007). 
      3. Nanog - гомеобоксный белок, специфично экспрессирующийся в ЭСК и клетках внуренней клеточной массы бластоцисты. Впервые описан I.Chambers в 2003г. Подавление активности в ЭСК приводит к быстрой дифференцировке. Повышение активности позволяет культивировать ЭСК без фидерного слоя клеток и добавления LIF. Более того, в 2006г. A.Smith et al. показали, что ЭСК с гиперэкспрессией Nanog обладают значительно более выраженной репрограммирующей активностью при слиянии с соматическими клетками (описание статьи - новость).
      4. STAT3 - белок из семейства STAT, необходимй для поддержания плюрипотентности ЭСК мышей. Является одной из сигнальных молекул пути сигнальной трансдукции, запускаемым рецептором LIF. 
      5. APC/b-catenin - белок с двойной функцией. Принимает участие в адгезии клеток путем связывания кадгеринов с актином цитоскелета клеток, а также является внутриклеточной сигнальной молекулой канонического пути сигнальной трансдукции Wnt.  Wnt/b-catenin путь сигнальной трансдукции поддерживет плюрипотентный статус ЭСК мышей.
      6. c-Myc - фактор транскрипции, содержащий домены типа "спираль-поворот-спираль" и "лейциновую застежку" (helix-loop-helix/leucine zipper). Регулируется белком STAT3 и играет важную роль в самообновлении и поддержании плюрипотентности ЭСК мышей (Cartwright et al., 2005). Является общей мишенью для Wnt/b-catenin и LIF путей сигнальной трансдукции.
      7. Klf4 - Kruppel-подобный фактор транскрипции. Впервые идентифицированный как опухолевый супрессор, который подвергается делеции в гастроинтестинальных опухолях (Zhao et al. 2004; Wei et al. 2005). С другой стороны, его гиперэкспрессия была обнаружена в клетках рака молочной железы. Klf4 в значительной степени экспрессируется в ЭСК, где, по-видимому, играет роль в поддержании самообновления (Li et al. 2005).

    Кроме того, в исследование были включены: 8 - Ecat1, 9 - Dppa5(Esg1), 10 - Fbxo15, 11 - ERas, 12 - Dnmt3l, 13 - Ecat8, 14 - Gdf3, 15 - Sox15, 16 - Dppa4, 17 - Dppa2, 18 - Fthl17, 19 - Sall4, 20 - Rex1(Zfp42), 21 - Utf1, 22 - Tcl1, 23 - Dppa3(Stella), 24 - Grb2.

    Для тестирования "перепрограммирующей" способности выбранных кандидатов Яманака использовал систему,в которой индукция плюрипотентости в соматической клетке могла быть обнаружена путем идентификации экспресии гена-маркера. В качестве гена-маркера был выбран Fbx15, который экспрессируется в ЭСК и клетках эмбриона на ранних стадиях развития, однако не является необходимым для поддержания самообновления и плюрипотентности ЭСК. С помощью ряда манипуляций были получены гомозиготные мыши, у которых в локус Fbx15 была вставленна кассета, содержащая гены  бета-галактозидазы (собственно маркер) и белка, опосредующего резистентность к неомицину. Эмбриональные фибробласты или фибробласты взрослых мышей трансфецировались ретровирусным вектором, который содержал гены "факторов-кандидатов". Трансфецированные клетки культивировались в среде с высоким содержанием неомицина (в работе использовался G418), в которой выживали те клетки, которые подвергались перепрограммированию и экспрессировали Fbx15, бета-галактозидазу и белок, опосредующий резистентность к неомицину. Неперепрограммированные соматические клетки не экспрессировали Fbx15 и, соответственно, погибали.

    Тестируя "факторы-кандидаты" авторы выявили следущие закономерности:
    - трансфекция клеток с любым одним "геном-кандидатом" не приводила к перепрограммированию;
    - трансфекция клеток со всеми 24 "генами-кандидатами" приводила к перепрограммированию;
    - комбинируя факторы, авторы выявили минимально необходимое для перепрограммирования сочетание факторов - Oct3/4, Sox2, c-Myc и Kfl4.;
    - один из главных кандидатов, Nanog, не оказался необходимым для перепрограммирования фибробластов;
    - эффективность перепрограмирования клеток 4-мя факторами составила приблизительно 0.02%

    Полученные перепрограммирование клетки, получившие название индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (induced pluripotent stem cells - iPS-cells, iPS-клетки), характеризовались схожей с ЭСК морфологией, способностью к пролиферации и дифференцировке. При трансплантации иммунодефицитным мышам они давали начало тератомам, содержащих производные всех трех зародышевых листков. Введение iPS-клеток в полость бластоцисты приводило к образованию химерного эмбриона.

    Тем не менее, у полученных в данной работе iPS-клеток имелся ряд недостатков, свидетельствовавших о неполном характере перепрограммирования клеток:
    - в исследовании не было выявлено постнатальной химеризации мышей, также как и химеризации клеток зародышевой линии при введении iPS-клеток в полость бластоцисты;
    - iPS-клетки характеризовались разным уровнем метилирования промотра гена Oct3/4, свидетельствующее о разной степени эпигенетических модификаций;
    - увеличение разницы в карте генной экспресии на микрочипах при пассировании клонов по сравнению с контрольными ЭСК (например, отсутсвие экспрессии Ecat1)
     
    Исследование было опубликовано в журнале Cell 25 августа 2006 г. (более подробное описание исследования - новость, оригинальная статья в приложении). 
               

[Transpl]

Глава 3 - Июньский бум 2007г. или получение полностью перепрограммированных iPS-клеток

         Работа Шиньи Яманака в 2006г. не осталась незамеченной в научном мире - многие исследователи уловили грандиозные перспективы, приоткрытые японским исследователем. Первыми к дальнейшим исследованиям присоединились Рудольф Джениш (Rudolf Jaenisch) и Конрад Хочедлингер (Konrad Hochedlinger), первый из которых является одним из самых авторитетных специалистов в эпигеномике, а второй его, пожалуй, лучшим учеником. 

         6 июня 2007г. в он-лайн версии журнала Nature опубликовано сразу 2 исследования (первое - Яманака, второе - Джениша и Хочедлингера), в которых сообщалось об усовершенствовании метода перепрограмирования соматических клеток мышей, индуцируемым эктопической экспрессией экзогенных факторов Oct3/4, Sox2, С-myc и Klf4.
   
         Обе группы исследователей изменили тактику в отношении выбора гена-маркера, по наличию экспрессии которого выявлялись перепрограммированные клетки. Напомним, что в первом исследовании Яманака в качестве гена-маркера использовал Fbx15, который хотя и экспрессируется в ЭСК и клетках эмбриона на ранних стадиях развития, но, тем не менее, не играет существенной роли в поддержании фундаментальных свойств ЭСК - самообновлении и плюрипотентности. В настоящих исследованиях авторы в качестве гена-маркера использовали Nanog (а Джениш еще и Oct3/4), который, в отличие от Fbx15, хорошо известен как один из ключевых факторов, обеспечивающих самообновление и плюрипотентность ЭСК. В остальном использованные в исследованиях методы были примерно одинаковы (использовались те же виды фибробластов - мышиные эмбриональные и мышиные взрослых животных).

         В обеих работах сообщалось о получении полностью перепрограммированных iPS-клеток, которые характеризвались следущими свойствами:
         - iPS-клетки характеризовались сходным с ЭСК глобальным паттерном экспрессии;
         - промотры генов Nanog, Oct3/4 и Fbx15 в iPS-клетках в отличие от соматических клеток и ранее полученных Fbx-15 iPS-клеток были полностью деметилированы;
         - изучение паттерна метилирования импринтируемых генов показал, что iPS-клетки являются аналогами ЭСК, а не эмбриональных половых клеток (EGCs);
         - iPS-клетки характеризовались идентичной ЭСК конфигурацией хроматина (показано только у Джениша);
         - iPS-клетки, как и ЭСК, но не соматические клетки, были устойчивы к тотальному демитилированию ДНК (показано только в работе Джениша);
         - при культивировании без фидерного слоя клеток и в присутствии LIF iPS-клетки пролиферировали и сохраняли недифференцированное состояние, тогда как добавление в культуру ретиноевой кислоты индуцировало быструю дифференцировку. Анлогичное поведение в культуре характерно и для ЭСК;
         - из бластоцист, в полость котрых вводились iPS-клетки, развивались жизнеспособные химеры;
         - введение iPS-клеток в полость бластоцист в ряде случаев приводило к химеризации клеток зародышевой линии. При дальнейшем скрещивании таких химер с нормальными мышами удалось получить потомство трансгенных мышей (F1), несущих генетический материал iPS-клеток (в т.ч. ретровирусы);
         - введение iPS-клеток в полость тетраплойдных бластоцист приводило к формированию эмбрионов (вплоть до средних и поздних стадий развития), полностью состоящих из производных введенных клеток (исследование описано только в работе Джениша). Этот метод вплоть до настоящего времени является самым точным и строгим тестом на плюрипотентность;     
         - эффективность перепрограммирования клеток составила 0.001–0.03% у Яманака и 0.05–0.1% у Джениша;

        Помимо детальной характеристики iPS-клеток в своей работе Джениш показал, что перепрограммирование сопровождается постепенным подавлением эктопической экспрессии экзогенных факторов. Это явление было обусловлено de novo метилированием вирусного вектора, что приводило к инактивации экспрессии содержащихся в нем генов. Более того, поддержание плюрипотентного состояния и индукция дифференцировки iPS-клеток четко зависела от экспрессии и нормальной регуляции именно эндогенных генов (в частности, Oct3/4 и Nanog). Отсюда важный вывод - после перепрограммирования iPS-клетки для сохранения своих основных характеристик не нуждются в дальнейшей эктопической экспрессии экзогенных факторов.     
       
        В свою очередь Яманака обнаружил у F1 трансгенных мышей высокую частоту образования злокачественных новообразований (у 17 из 121). Детальный анализ показал, что возникновение опухолей было обусловлено реактивацией экспрессии c-Myc в составе интегрированных в геном ретровирусных векторов.

        Описание июньских событий было бы не полным, если не упомянуть о еще одной публикации Джениша/ Хочедлингера и Катерины Плат, которая вышла на день позже - 7 июня 2007г. в первом номере журнала Cell Stem Cell. Интерес в исследовании вызывает анализ статуса X-хромосом в iPS-клетках, полученных от женских особей. В соматических клетках одна из X-хромосом всегда находится в инактивированном состоянии. В стабильных линиях XX-ЭСК обе Х-хромосомы активны, однако в процессе дифференцировки одна из хромосом инактивируется (один из наиболее ярких примеров формирования гетерохроматина в клетках млекопитающих). Соответственно, авторы продемонстрировали, что в процессе перерпрограммирования инактивированная Х-хромосома подвергается реактивации и в iPS-клетках, аналогино ЭСК, присутствуют две активные Х-хромосомы. В процессе дифференцировки iPS-клеток происходила инактивация одной из Х-хромосом, причем, что важно, вероятность инактивации той или иной хромосомы носила случайный характер.     

       В целом, в опубликованных в июне 2007г. работах двух исследовательских групп сообщается о получении полностью перепрограмированных iPS-клеток, которые по своим характеристикам соответствовали ЭСК. В дополнении к методам, используемых в Яманака, Джениш и Хочедлиндгер, как и ожидалось от авторитетных специалистов в эпигеномике, провели максимально детальный анализ эпигенетического статуса iPS-клеток. И если публикация Яманака в 2006г. была воспринята с изрядной долей скепсиса, то после настоящих публикаций уже мало у кого оставались сомнения. К исследованиям, связанных с iPS-клетками, стали экстренно подключаться ведущие лаборатории мира.       
 

        Описание работы Джениша - новость.
        Статьи из Nature в аттаче!
        Статья из Cell Stem Cell в свободном доступе - Full Text 

[Transpl]

Глава 4 - Второе из самых значимых открытий 2007г. по версии Science

       После июньских публикаций Яманака, Джениша и Хочедлингера уже ни у кого не вызывало сомнений, что в ближайшее время будут предприняты попытки получить iPS-клетки человека. В научной практике не раз уже было показано, что экспериментальные данные, полученные на мышках, почему-то не воспроизводятся у человека. Сработает ли на этот раз? Сработало.. 

       
       30 ноября 2007г. в журнале Cell и он-лайн версии журнала Science вышли публикации Шиньи Яманака и Джеймса Томсона (того самого, который упоминался в первой главе), в которых сообщалось об успешном получении iPS-клеток человека.
       
       Методы, применяемые Яманака, были аналогичны таковым в ранее опубликованных исследованиях. Использовались несколько другие условия культивирования (применяемые для культивирования ЭСК человека) - на 6-ой день трансфецированные фибробласты переносились на фидерный слой клеток + добавлялся bFGF. Аналогичные условия ультивирования использовал и Томсон.

       В свою очередь Томсон использовал несколько другой путь. Ранее он уже имел опыт перепрограммирования соматических клеток человека (миелойдных клеток-пердшественниц) путем клеточного слияния с эмбриональными стволовыми клетками (статья в свободном доступе - Full Text). В настоящей работе Томсон определил 14 "своих" генов-кандидатов, экспрессия которых в ЭСК была значительно выше, чем у миелойдных клеток-предшественниц, и, значит, вероятно имменно они являлись факторами перепрограммирования. В целой серии экспериментов, аналогично выполненных Яманака в 2006г., Томсон определил и использовал собственную комбинацию факторов - Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28.   

       Эффективность перепрограммирования клеток человека составила:
        - Яманака - 10 колоний iPS-клеток из 50 000 фибробластов кожи взрослого человека - 0,02%
        - Томсон - 57 колоний из 600 000 фибробластов крайней плоти новорожденных - 0.01%

       
       Реакция мировой научной общественности на выход публикаций Яманака и Томсона не заставила себя ждать. Журнал Science определил получение iPS-клеток человека, как второе из самых значимых научных открытий 2007 года (ссылка). А в сети появился термин Embryonic Stem Cells 2.0, по своей сути отражающий новый всплеск интереса общественности к плюрипотентным стволовым клеткам.

       Чуть позднее об успешном получении iPS-клеток человека заявили знаменитый Джордж Дейли из Бостона (Abstract) и Катерина Плат из Центра стволовых клеток и регенеративной медицины Калифорнийского университета (Abstract). 


           

[sergey2010]

Кстати, с грустью должен признать, что термин перепрограммирование или репрограммирование цепко прилип к индуцированным клеткам. Т.е. масло масленное оказалось наиболее съедобным. Что ж, придется быть как все.